Я ищу высококомпетентный штамм кишечной палочки. Я делаю библиотеку из плазмиды ~ 6,6 КБ, и я не получаю достаточно высокой эффективности. Кто-нибудь может предложить штамм/протокол со сверхвысокой эффективностью (>10 10 ).
Это отличный вопрос, так как я только что сделал свои собственные «доморощенные» химически компетентные клетки.
Существует огромное разнообразие штаммов кишечной палочки , которые обычно используются для клонирования. Они могут быть преобразованы химически методом теплового шока или электрически путем электропорации (краткое описание можно найти здесь ). Их можно изготовить в лаборатории вручную или приобрести у известных поставщиков (рекомендую Invitrogen/Life Tech, NEB, Promega).
Химическая компетентность достигается с использованием метода Ханахана или его разновидности. Метод включает промывание бактерий в серии буферов, содержащих различные хлоридные соли двухвалентных катионов (CaCl 2 , RbCl 2 и т.д.). Коммерчески доступные E. coli продаются как «обычные» и «ультра» компетентные, в пределах от 10 6 до 10 6 для обычных, и самое высокое, которое я видел, составляет 10 10 КОЕ/мкг ДНК. Для максимальной эффективности, особенно с учетом того, что маленькую плазмиду, такую как ваша, будет легко трансформировать, электропорация является более эффективным методом, но требует специального оборудования . Электропорация может дать> 1010 КОЕ/мкг . Для стандартной практики клонирования вполне достаточно обычной или высокоэффективной химически компетентной E. coli. Поскольку вы упомянули, что создаете библиотеку, вы, безусловно, хотите использовать сверхвысокоэффективную химическую трансформацию или, если у вас есть необходимое оборудование, электропорацию. Я не видел сообщений об эффективности электропорации > 5x10 10 .
Эффективность трансформации стандартизируют, сообщая скорость как количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на мкг некоторой контрольной плазмиды, обычно pUC19. Эффективность трансформации очень чувствительна ко многим факторам, включая время теплового шока, время охлаждения, время оттаивания, количество и размер плазмидной ДНК. При прочих равных условиях размер и количество ДНК важны для ваших целей. Эффективность трансформации обычно увеличивается с количеством ДНК, но существует точка насыщения, и, в конце концов, наличие слишком большого количества ДНК снижает выход. Кроме того, эффективность уменьшается линейно с размером плазмиды. Например, pUC19, контрольный вектор, имеет размер ~2,7 т.п.н., а плазмида вашей библиотеки ~6,6 т.п.н., поэтому вы должны ожидать, что для той же массы ДНК вы потеряете 60% трансформации из-за размера плазмиды.
Я слышал, что электрокомпетентные клетки Epi300 ( 1 ) от Epicenter очень эффективны: > 1 x 10 10 КОЕ/мкг pUC19. Дэн Гибсон использовал их в своей статье для синтеза митохондриального генома ( 2 ). Мы тоже думали использовать их для наших сборок, но они довольно дорогие.
1. TransforMax™ EPI300™ Электрокомпетентная кишечная палочка
2. Химический синтез митохондриального генома мыши, Gibson et. др.
пользователь560