Какие проблемы возникают при использовании оцДНК или мРНК для экспрессии вместо использования плазмиды?

Допустим, вы хотите провести эксперимент по клонированию генов. У вас есть пустой вектор экспрессии (мРНК или ДНК), и вы хотите клонировать в него некоторый ген X. Почему вы можете купить X только внутри вектора (который, в свою очередь, часто находится внутри бактериального носителя)?

В чем проблема обработки чистых нуклеотидов мРНК гена X? Или даже оцДНК?

Плазмиды являются переносчиками. Вставленный ген называется клоном или просто вставкой, которую несет вектор.
@WYSIWYG Нет, векторы - это векторы, плазмиды - это плазмиды, в некоторых случаях плазмиды действительно являются векторами. Но в буквальном смысле плазмида — это просто фрагмент ДНК.
Я имел в виду плазмиды, используемые в молекулярной биологии, а не природные плазмиды.

Ответы (1)

В чем проблема обработки чистых нуклеотидов мРНК гена X? Или даже оцДНК?

Проблемы прямой трансфекции мРНК/оцДНК

мРНК можно трансфецировать в клетки, и это довольно часто делается. Проблема прямой трансфекции мРНК заключается в том, что мРНК быстро разрушается, и у вас не будет устойчивой экспрессии. Это, однако, очень полезно в некоторых случаях, таких как создание индуцированных плеврипотентных стволовых клеток (ИПСК), когда вы не хотите, чтобы клетки постоянно экспрессировали факторы Яманаки (некоторые из которых также являются онкогенами).

Кроме того, РНК как таковые весьма подвержены деградации. Гораздо проще готовить и хранить растворы ДНК в течение длительного времени.

Аналогичные проблемы возникают с оцДНК.

Почему вы можете купить X только внутри вектора (который, в свою очередь, часто находится внутри бактериального носителя)?

Одним из больших преимуществ использования плазмид является то, что вы можете бесконечно размножать свой ген. Если вместо этого вам дали фиксированное количество мРНК, то оно скоро закончится. Некоторые продавцы практикуют такую ​​жадную капиталистическую политику :P

Когда вы амплифицируете ДНК с помощью ПЦР, клонирование имеет дополнительные преимущества:

  • вы можете секвенировать ген, используя хорошо стандартизированные праймеры (например, T7)
  • вы можете создавать конструкции, которые могут условно экспрессировать ген

У вас есть пустой вектор экспрессии (мРНК или ДНК), и вы хотите клонировать в него некоторый ген X.

Вы не можете легко клонировать что-то внутри РНК. Вам нужны специфические РНК-эндонуклеазы. Более того, двойное пищеварение в этом случае будет губительным.

Почему поставщики обычно не продают вставку двухцепочечной ДНК, а предоставляют ее клонированную в плазмиде

  • Кольцевая дцДНК более стабильна.
  • Поставщики могут оставить запас вкладышей для будущих клиентов без необходимости повторного проведения ПЦР.
  • Клонированная вставка может быть амплифицирована с помощью бактериальных культур для получения очень больших количеств (препараты макси/гига).
Я думал с точки зрения рабочего процесса. Когда вы покупаете плазмиду (обычно двухцепочечную ДНК у бактерий), вам нужно сначала извлечь плазмиду, затем вырезать ORF, затем амплифицировать и лигировать экстракт ORF с вашим собственным вектором. Почему они просто не продают флаконы ORF? Это также должно быть легко для саморазмножения.
@jiggunjer Нет, обычно вы не покупаете бактериальную культуру, несущую плазмиду. Вы просто растворяете плазмиду в Tris-Cl pH 7,5. Линейная ДНК, содержащая только ORF, не может саморазмножаться. Вы можете провести ПЦР с кусочком ДНК, но с бактериальными культурами вы можете получить много ДНК (препараты макси/гига). Кольцевая ДНК также относительно более стабильна.
Даже если получить чистую плазмиду, почему не чистую ORF. Я признаю, что аргумент «некруглый менее стабилен» звучит довольно убедительно. Я знаю, что они не могут самораспространяться, но именно поэтому я упомянул пустой вектор. Так что просто купите ORF, ПЦР и лигируйте. Я не очень опытен в лаборатории, но я пытаюсь освоить протокол, это кажется излишне трудоемким.
@jiggunjer Вы получаете пустой вектор без вставки. Некоторые поставщики также продают предварительно расщепленный/линеаризованный вектор.
@jiggunjer Продавцы не продают предварительно обработанные вставки по той причине, что не существует единого стандартного вектора. Разные векторы имеют разные сайты экспрессии, для клонирования которых требуются разные ферменты рестрикции. Продажа ORF будет означать, что поставщик должен иметь запас сотен различных комбинаций липких концов и рекомбиназных концов. Конечному пользователю гораздо проще извлечь фрагмент с помощью PCR и субклонировать его.
Какие проблемы возникают при использовании оцДНК или мРНК для экспрессии вместо использования плазмиды?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v