Будет ли эта стратегия работать для проверки успешного клонирования фрагмента ДНК в плазмидный вектор?

Так что я немного ограничен во времени. По сути, я вставил фрагмент ДНК с помощью молекулярного клонирования, который содержит уникальный сайт RE. Мне нужно подтвердить, есть ли в моей колонии фрагмент. Мне нужно сделать это за один день, так что это сработает как стратегия подтверждения:

  1. Выберите колонию и выполните ПЦР колонии с праймерами вокруг сайта RE.
  2. Очистите продукт ПЦР и переварите с помощью введенного фермента.
  3. Бегать на геле. Если заметен разрез, это подтверждает, что в колонии был встроенный фрагмент (содержащий сайт RE).

Сработает ли эта стратегия? Есть ли какие-либо заметные проблемы, которые люди могут увидеть в этой стратегии?

Ответы (2)

Да, ваша стратегия сработает, с оговорками, уже упомянутыми @Cell.

В зависимости от того, какой рестрикционный фермент и буфер для ПЦР вы используете, вы можете даже пропустить шаг 2. У NEB есть хороший список их рестрикционных ферментов и их активности в некоторых распространенных буферах для ПЦР. С некоторым соображением эта информация часто применима и к рестрикционным ферментам других марок.

В зависимости от наличия у вас праймеров, другой быстрой стратегией является простое использование пары праймеров, так что один праймер связывается внутри вашего фрагмента, а другой связывается с основой. Это должно привести к продукту ПЦР только в том случае, если ваше клонирование было успешным, а также проверяет правильное направление (в случае, если вы использовали клонирование с тупым концом или с одним сайтом). Две возможные проблемы с этим подходом:

  1. Если у вас вообще нет полос, вы можете не знать, что было неудачным: ваше клонирование или ПЦР-реакция. Последнее можно легко контролировать с помощью хорошо продуманного положительного ПЦР-контроля.
  2. Вы можете обнаружить случаи, когда было вставлено более одной копии вашего фрагмента. Хотя такие случаи редки, иногда случается, что инвертированные повторы из 3, 5, 7, ... и т. д. копий вставляются последовательно.

Одна из проблем заключается в том, что если ваш амплифицированный фрагмент слишком мал, вы не сможете увидеть положительный результат двух полос, потому что они стекают с геля. Также RE может не эффективно вырезать небольшой фрагмент.

Я бы порекомендовал извлечь и очистить плазмиду, а затем провести двойной перевар, используя уникальный фрагмент, разрезающий RE, и RE, который разрезает только основу. Вы должны увидеть либо линеаризованную плазмидную ДНК, либо две полосы, которые, вероятно, имеют размер >1 т.п.н. и легко различимы.

Я бы поставил под сомнение эффективность разрезания, поскольку часто продукты ПЦР-амплификации имеют рестрикционные концы и легко клонируются в векторы.
Может быть, это зависит от того, как далеко находятся ваши праймеры, но, согласно этой статье NEB, вам нужно несколько дополнительных последовательностей ДНК с обеих сторон сайта разреза для эффективного расщепления neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/… Поскольку вы не указал, я предполагал худший случай, когда ваш участок вырезания находится в самом конце амплифицированного продукта.
Да, обычно это от 4 до 5 п.н...... мои праймеры "двойной проверки" амплифицируют 500 п.н. с каждой стороны сайта RE. Он должен хорошо расщепляться. Кроме того, 1000 б.п. против 500 б.п. было бы очень заметно.
Будет ли эта стратегия работать для проверки успешного клонирования фрагмента ДНК в плазмидный вектор?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v