Цель: количественно определить активность обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ-1 для ряда мутировавших ОТ.
Идея:
Поместите RT в вектор в E.coli.
Доставить мРНК GFP в E.coli.
RT будет обрабатывать мРНК.
Полученная ДНК будет интегрирована в E. coli.
Активность RT коррелирует с GFP, который мы наблюдаем.
Первый вопрос: имеет ли эта логика смысл?
Второй вопрос: Альтернативная процедура?
тут дьявол кроется в деталях — с логикой все в порядке, но эксперимента здесь нет. Слишком много вопросов без ответов.
Вы делаете что-то конкретное, чтобы оптимизировать активность RT?
Как вы предотвращаете превращение вашей мРНК GFP в белок, производя гораздо больший сигнал, чем вы когда-либо увидите от активности RT?
После того, как он будет интегрирован в хромосому, как этот ген будет экспрессироваться, если он был подавлен на всех этих других стадиях?
Откуда вы знаете, что плазмида не встраивается в хромосому каким-то другим способом?
Откуда берется РТ? У кишечной палочки нет этого гена. этот эксперимент, скорее всего, не даст никаких результатов.
Когда/как работает этот RT? Если это какой-то фаговый RT (я не знаю, существуют ли такие вещи), любой вирусный RT, вероятно, убьет клетку, как обычно.
так много вопросов, прежде чем это сработает - здесь нужно сделать домашнее задание.
Я с @Mad Scientist. Избавьте себя от хлопот и сделайте это в системе in vitro . На данный момент вы даже не знаете, будет ли ВИЧ-RT экспрессироваться или быть активным в E.coli .
Скорее экспрессируйте мутировавший ВИЧ-RT в Т-клетках или лизате кролика. Очистить.
Добавьте шаблон РНК с соответствующим праймером.
Гидролизуйте свою РНК
Определите свою кДНК.
Мне нравится, что вы рассматриваете простой и стандартизированный подход. Тем не менее, есть ряд потенциальных подводных камней, которые следует учитывать в этом предложении. Прежде всего, какую конкретную активность RT вы пытаетесь количественно оценить? Это скорость или точность транскрипции, или вы пытаетесь охарактеризовать что-то совсем другое? Если вы измеряете скорость, как и что вы будете измерять, надежно и воспроизводимо для скорости? Если вы стремитесь к точности, вам понадобится много секвенирования, чтобы проверить правильность оснований. Оба они могут быстро стать дорогими.
Кроме того, необходимо ли использовать РТ ВИЧ-1? Поскольку вы упомянули кишечную палочку, не хотели бы вы рассмотреть возможность использования msr, прокариотической RT?
Хотя я никогда не слышал и не пробовал это сам, возможно ли превратить мРНК в бактерии? Я полагаю, что он будет деградировать как естественный защитный механизм. Возможно, вам придется рассмотреть альтернативную форму доставки генов, например стандартную экспрессионную плазмиду. Геномная интеграция может не понадобиться для достижения вашей цели.
Как уже упоминалось, вы не можете просто использовать голую кДНК для трансляции белка. Вам нужен по крайней мере промотор, сайт связывания РНК pol и сигнал полиА. Вы можете воспользоваться преимуществами систем вирусной инфекции (ВИЧ с дефектом репликации) для доставки ваших генов GFP и RT в систему млекопитающих (например, в клетки HEK-293), но это добавляет много сложности и затрат, которые могут оказаться нецелесообразными.
И, наконец, вы бы больше всего выиграли от эксперимента по направленной эволюции, чтобы получить потенциальных потенциальных клиентов. Например, вы можете провести ПЦР-амплификацию кДНК ОТ с подверженным ошибкам Taq для создания мутантов ОТ для использования в вашем анализе.
Продолжайте думать об этом и, возможно, проверьте веб-сайты некоторых коммерческих поставщиков RT. Возможно, одна из этих компаний уже сделала что-то подобное.
Сумасшедший ученый