Как измеряется частота ошибок ДНК-полимеразы?

Хорошо известно, что первая ДНК-полимераза Taq весьма подвержена ошибкам. Коммерческие ферменты нового поколения, которые были либо выделены из различных видов термофилов, либо улучшены путем рекомбинации, менее подвержены ошибкам. Как эти частоты ошибок сравниваются? Например, если это делается с помощью секвенирования по Сэнгеру, средний сигнал будет доминировать при считывании выходных данных, и поэтому очень маловероятно, что этот метод уловит ошибки.

Продукты Taq можно было клонировать перед секвенированием. Тем не менее, это все еще сложно, потому что одна и та же ошибка в двух продуктах может представлять одну и ту же ошибку, возникшую дважды de novo, или распространение одной ошибки, возникшей на раннем этапе амплификации.
Вот почему я скептически относился к подходу, основанному на секвенировании. Я предполагаю, что метод, описанный Аланом Бойдом ниже, является функциональным подходом, но он по-прежнему маскирует синонимичные мутации и, следовательно, занижает истинную частоту ошибок.

Ответы (1)

Согласно их веб -сайту, New England Biolabs использует версию подхода, впервые предложенного Уэйном Барнсом, как описано в:

Кермекчиев М.Б., Цеков А. и Барнс В.М. (2003) Nucl. Кислоты рез. 31, 6139–6147

Это в основном анализ скорости мутации в ПЦР-амплифицированном гене lacZ (β-галактозидаза), анализируемый путем трансформации E. coli , посева на хромогенный субстрат β-галактозидазы Xgal, а затем подсчета белых колоний как мутировавших генов. Также, согласно NEB, Agilent Technologies использует аналогичный мутационный анализ, но основанный на гене lacI (lac-репрессор).

Спасибо за ссылку. Это кажется наиболее прагматичным подходом к этой проблеме. Несмотря на то, что по замыслу этот метод занижает частоту ошибок, он будет постоянным смещением для полимераз.
Возможно, где-то они откалибровали мутационный анализ для более строгого подхода, но я просто предполагаю. Как вы говорите, для них относительная достоверность важнее абсолютной ценности.
Как измеряется частота ошибок ДНК-полимеразы?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v