Как долго можно хранить запасы E. coli при температуре -20°C?

Я работаю волонтером в лаборатории биохакеров - biocurious в Саннивейле. У них неплохой набор оборудования - гелевые боксы, инкубаторы, но пока нет морозильной камеры -80°С.

Я хотел бы создать несколько глицериновых штаммов некоторых штаммов кишечной палочки, но мне сказали, что даже нетрансформированные (т.е. не плазмидные) бактерии через некоторое время становятся забавными при -20°C. Также было бы неплохо узнать, как долго можно хранить штамм, трансформированный плазмидой, при температуре -20°C.

Кто-нибудь может сказать конкретно, что происходит и сколько времени требуется, если вы храните их при температуре -20 ° C в течение длительного периода времени?

Я немного почитал о компетентных клетках и думаю, что они остаются активными около 4 дней без морозильной камеры до -80°C.

Я так понимаю, что все думают, что бактерии просто погибнут при -20С. Я задал этот вопрос, потому что мне было интересно, не является ли он апокрифическим. Все «знают», что -80°C — лучшая температура для уколов глицерином, но мне интересно, нужна ли она на 100%, особенно в течение примерно 3-4 месяцев. Однако есть хорошие предложения. Я попробую его с некоторыми уколами, а также получу несколько штаммов с дефицитом протеазы.
Вы также можете начать хранить трансформированные клетки (с маркером лекарственной устойчивости) при температуре -20°C и каждый день высевать некоторые из них и смотреть, как быстро они теряют плазмиду. Вы можете сделать то же самое с нетрансформированными компетентными клетками.
некоторые большие моменты здесь. Если все в порядке, я собираюсь проверить ответы, чтобы увидеть, кто прав, прежде чем выбрать один. если кто-то находится в районе полуострова в районе залива Сан-Франциско, вы можете прийти в biocurious и проверить это. ;)
Я мог бы это сделать :) Можете ли вы написать мне (gvandova@stanford.edu) с некоторыми подробностями об этом?
похоже, что это 1 год при -20C.. opsdiagnostics.com/notes/ranpri/…
Мать-природа тебя прикрыла. -136 ˚F (-93,2 ˚C). Найдите образцы: в небольшой долине между двумя пиками на Восточно-Антарктическом плато. ~ 10 декабря 2013 г .; ;) Возможно, это не то, что вы искали, но для этого момента времени вы могли бы просто нанести удар на заднем крыльце. Сейчас холодный день! blogs.scientificamerican.com/observations/2013/12/10/…
Привет @GerganaVandova - я только что просмотрел это и понял, что никогда не связывался с тобой. Вскоре после этого вопроса у меня родился второй ребенок, и после этого я почти не возвращался к биолюбопытству :/ Извините!

Ответы (3)

Я думаю, что клетки повреждаются при -20°С не потому, что они долго хранятся, а потому, что они подвергаются циклам оттаивания и замораживания (образующиеся кристаллы льда повреждают их).

Я никогда не держу клетки при -20°C. Я храню их при -80°C в 50% глицерине. Идея глицерина заключается в том, что он служит криопротектором. Он образует водородные связи с молекулами воды и тем самым разрушает водородные связи вода-вода. В результате нарушается кристаллообразование льда, и клетки не замерзают. Температура замерзания глицерина составляет -37,8°С (60-70% глицерина в воде), а это означает, что при -20°С глицерин не замерзает и поэтому не может защитить клетки от повреждения образованием кристаллов льда.

Хороший морозильник с температурой -20°C не должен циклически переключаться между замораживанием и оттаиванием. Это проблема с безморозными морозильными камерами, прогревающимися почти до 0°C. Действительно, глицерин — это уловка для сохранения целостности мембраны. Десятилетия назад исследователи хранили свои бактериальные культуры при комнатной температуре, в темноте, в так называемых «коллекторах».
Когда я говорил о цикле замораживания-оттаивания, я имел в виду, когда вы берете замороженный образец из морозильника, делаете с ним что-то (он оттаивает), а затем кладете его обратно в морозильник (он замерзает).
Это интересный ответ - если это только кристаллы льда, то можно использовать 40% глицерин, и раствор замерзнет, ​​оставаясь в основном таким же хорошим криопротектором. en.wikipedia.org/wiki/… Я склонен думать, что там могут быть более конкретные ответы… работает.
@shigeta Я не знал, что протеазы активны при -20 ° C (ответ Леонардо). Но попытка (по крайней мере, краткосрочная) того стоит, если вы не храните клетки слишком долго.

Гергана рассмотрела часть «почему» вашего вопроса. +1

Если все, что у вас есть на данный момент, это -20 ° C, и в основном вы хотите хранить плазмиды E. coli , я бы рекомендовал подготовить плазмидную ДНК и хранить ее при -20 ° C. ДНК останется стабильной в среднесрочной перспективе, и вы сможете повторно трансформироваться в кишечную палочку , как только ваш морозильник с температурой -80°C заработает. И в идеале вам нужны как запасы ДНК, так и запасы бактерий - вы никогда не знаете, когда морозильник выйдет из строя.

Для ваших нетрансформированных штаммов вы можете сделать агаровые пластины или чашки для хранения при 4°C. Я пересаживал их каждые 1-2 недели, выращивал в течение ночи при 37°C, а затем снова помещал в холодильник.

Уже опубликованные ответы о том, что глицерин является криопротектором и кристаллами льда, верны. Еще одна вещь, которую следует учитывать, это то, что ферменты все еще сохраняют некоторую активность при -20 ° C, и хотя скорость реакции ниже, клетки будут деградировать до тех пор, пока они не перестанут быть жизнеспособными. Я всегда храню глицериновые запасы бактерий при -80°C.

Многие распространенные штаммы E. Coli, коммерчески используемые для клонирования, не свободны от протеаз, и именно эти ферменты ответственны за деградацию клеток.

Какие ферменты активны при -20°С?
Протеазы. Только что отредактировал свой пост.
Как долго можно хранить запасы E. coli при температуре -20°C?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v