Как NHEJ вызывает вставки?

Это очень интересный вопрос, и я не думал об этом раньше. Я повторяю предысторию вашего вопроса.

Фон

Cas9 разрезает обе нити ДНК-мишени в одном и том же месте, тем самым делая разрез с тупым концом. Обычно липкие концы и микрогомологичные концы приводят к вставкам из-за экзонуклеолитического клиппирования и добавления дополнительных оснований с помощью pol-µ. Вопрос в том, как возникают вставки во время опосредованного NHEJ повторного лигирования тупых концов.

---

NHEJ не всегда может привести к вставкам. Большинство порезов с тупым концом можно исправить без ошибок. Некоторые нетупые порезы также идеально перевязываются; лучшим примером этого является рекомбинация VDJ. Связывание белков Ku необходимо для идеального повторного лигирования (канонический NHEJ/C-NHEJ).

Однако существуют некоторые варианты неканонических путей, которые включают альтернативный-NHEJ, резервный-NHEJ и соединение концов, опосредованное микрогомологией (MMEJ) ( Bétermier et al. 2014 ). В некоторых исследованиях все эти пути также называются альтернативными NHEJ или altNHEJ. Эти альтернативные пути включают резекцию нуклеотидов экзонуклеазами, такими как Mre11, для образования выступов. Несовершенное выравнивание этих выступов перед лигированием приводит к вставкам. Иногда нешаблонное добавление нуклеотида происходит под действием терминальной дезоксирибонуклеотидтрансферазы (TdT). Pol-µ также может добавлять случайные нуклеотиды на 3'-конце ( Lieber 2010 ).

В целом, склонность к DSBR через альтернативные пути NHEJ будет выше, когда активность Ku ниже. Даже при умеренной активности Ku всегда существует некоторая вероятность того, что в действии будут действовать альтернативные пути. Кроме того, следует отметить, что перевязки с липкими концами более эффективны, чем перевязки с тупыми концами.

---

^{Воспроизведено из Bétermier et al. 2014}