Альтернативы ПЦР

ПЦР использует циклы нагревания и охлаждения для денатурации нитей, что требует специальных термостабильных ДНК-полимераз. В клетке во время репликации геликаза раскручивает ДНК без необходимости нагревания. Можно ли использовать геликазу вместо термоциклирования для получения одноцепочечной ДНК? Устранит ли это необходимость в термоциклировании и, следовательно, в специальных термостабильных полимеразах?

Температура циклически повторяется, потому что мы хотим контролировать реакцию. Мы контролируем реакцию, чтобы размножить ДНК до необходимого уровня. Обычно достаточно тридцати-сорока циклов. Вы не можете контролировать геликазу таким же образом. Так что нет, геликаза не может быть использована вместо этого.

Ответы (2)

Отредактировано после уточнения вопроса,

Начнем с нормальных функций обоих ферментов. Геликазы разделяют нити ДНК, в то время как полимераза синтезирует нити ДНК, как показано на следующем рисунке. (Источник изображения: Викисклад )

введите описание изображения здесь

Посмотрите эту анимацию, она рассеет ваши сомнения по поводу функциональности. Однако РНК-полимераза обладает обеими видами активности.

В клетках для разделения цепей ДНК требуется действие хеликазы. После этого может действовать только полимераза. Во время ПЦР разделение нитей происходит за счет повышения температуры. Этот процесс называется плавлением ДНК . Обычно эта температура очень высока, около 90 о С к 100 о С в зависимости от вашей последовательности. При этой температуре многие белки не будут функционировать, поэтому вам нужна термостабильная полимараза. Около 40 лет назад такой фермент был обнаружен у экстремофилов ( Chien et al 1976 ). Теперь он коммерчески доступен как полимераза Taq . Эти ферменты представляют собой рекомбинантные белки с несколькими мутациями, которые также увеличили их выход и стабильность ( Villbrandt et al 1997 ).

Теперь перейдем к вашему основному вопросу ( который, я думаю, на этот раз я правильно понял ).

Концепция, о которой вы спрашиваете, уже была успешно протестирована при обнаружении РНК. Исследователи использовали « изотермическую обратную транскрипцию термофильной геликазозависимой амплификации » ( Goldmeyer et al 2007 ). Они использовали не только геликазу, но и обратную транскриптазу (потому что они обнаруживали РНК). На следующем изображении (взято из статьи) показаны основные этапы этого процесса. Кружки обозначают ДНК-полимеразу, квадраты — обратную транскриптазу, треугольники — геликазу.

введите описание изображения здесь

Цитата из статьи (пункты списка мои),

Стрелки указывают на конкретные праймеры, кружки — на ДНК-полимеразу, квадраты — на обратную транскриптазу, треугольники — на геликазу. кДНК первой цепи синтезируется обратной транскриптазой.

  • (шаги 1 и 2). Гибриды РНК-ДНК, полученные в результате обратной транскрипции, затем разделяются геликазами UvrD , образующими одноцепочечные (ss) матрицы РНК и ДНК .
  • (шаги 3 и 4). ssRNA вступает в следующий раунд реакции RT
  • (этап 5-а), генерируя больше первой цепи кДНК. ОцДНК была преобразована в двухцепочечную ДНК с помощью ДНК-полимеразы.
  • (шаг 5-b) и одновременно амплифицируется в реакции tHDA
  • (шаги 6-9). Этот процесс повторяется для достижения экспоненциальной амплификации целевой последовательности РНК.
Я думаю, вы неправильно поняли вопрос: вопрос был не в том, может ли геликаза заменить полимеразу в ПЦР, а в том, может ли она заменить термоциклирование.
Спасибо за ответ, но Конрад Рудольф прав. Я хотел спросить, можно ли вообще избежать тепловых циклов.
Ах хорошо. Я отредактирую ответ соответственно. Теперь формулировка стала лучше и понятнее.
CubeMaker, @KonradRudolph, проверьте сейчас. Я отредактировал ответ. Я думаю, это то, что вы ищете.

Разработаны технологии изотермической амплификации ДНК. Вам не нужно термоциклирование для амплификации фрагментов ДНК этим методом.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17720718

Альтернативы ПЦР
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v