Адаптеры Y связывают различные последовательности, подлежащие гибридизации с 5'- и 3'-концами каждой молекулы в библиотеке.
Плечи Y уникальны, а средняя часть, связанная с фрагментом ДНК, комплементарна.
Каковы преимущества этого?
Мое мнение по поводу наличия полностью дополнительных адаптеров (ADAPTER1 - - - - - ADAPTER1) заключается в следующем:
- При отжиге праймера праймер, в свою очередь, будет связываться с началом И концом фрагмента ДНК и, таким образом, не позволит продолжиться синтезу до конца. Следовательно, у следующего праймера не будет шаблона для связывания в начале фрагмента...
Y-образные адаптеры также позволяют секвенировать парные концы. Фрагменты имеют уникальную последовательность на обоих концах, что позволяет при первом «прогоне» секвенировать одну сторону всех молекул, а затем синтезировать обратную и секвенировать эту.
Я на правильном пути?
Обычно, когда вам нужны два уникальных адаптера, скажем, A и B, на каждом конце неизвестных последовательностей вставки, лигирование когезионных концов затруднено, поскольку последовательности вставки «неизвестны». Таким образом, вы должны выполнить лигирование адаптера с тупым концом в реакции, содержащей Неизвестные вставки + адаптер A + адаптер B. Это может привести к 3 возможным версиям лигированного продукта: A-вставка-A, B-вставка-B и A -insert-B , среди которых только A-insert-B является единственным желаемым продуктом.
1) Лигирование А-образных вставок с Y-образными адаптерами дает вам 100% А-вставку-В .
2) Теперь давайте назначим вставку направленность - скажем, от основания 1 до основания 400. После лигирования Y-адаптера у вас будет 2 типа лигированных вставкой продуктов на вставку: A-вставка (1--> 400)-B и A-Insert(400-->1)-B , оба очень полезны. Каждый из них создаст отдельный клональный кластер, и вы получите информацию о последовательности, начиная как с основания 1, так и с основания 400 вставки, поскольку при однократном секвенировании прибор всегда производит последовательность с адаптера A. Однако знать, что обе эти последовательности принадлежат ту же вставку, нужно будет выполнить секвенирование парных концов.
Алан Бойд