Как сине-белый скрининг работает при отборе кишечной палочки, поглотившей плазмидный вектор?

Я имею в виду плазмидный вектор pCR 2.1-TOPO. Я добавил вектор к кишечной палочке и поместил их на чашку LB+amp+X-gal, а затем инкубировал. После инкубации на чашках были два типа бактериальной культуры, один белый и один синий.

Я думаю, что голубые культуры приняли плазмиду, поскольку они способны расти на ампициллине, имеют ген устойчивости к ампициллину и способны преобразовывать субстрат X-gal в синий через ген lac Z. Что меня смущает, так это белые колонии. Если колонии способны расти на ампициллине, несомненно, они приняли ген, потому что у них есть резистентность, и, конечно же, они должны иметь возможность преобразовать X-gal?

Так почему же они не экспрессируют ген lac Z? Это связано с тем, что ген lac Z и устойчивость к ампициллину не находятся на одной и той же плазмиде, или ген lac z не попал в плазмиду?

Какой штамм кишечной палочки вы использовали? Был ли это набор для клонирования ТА? Вы также добавили вставку ДНК любого типа?
Я полагаю, что это был штамм k12, да, это был набор для клонирования TA, и я добавил ДНК из Aequoria victoria в вектор, который заставил бактерии флуоресцировать.

Ответы (1)

Традиционный сине-белый скрининг устроен так, что синие колонии считаются отрицательными для вставки, а белые колонии — положительными для рекомбинантной ДНК. Ответственным за это геном является ген lacZ, или бета-галактозидаза. Этот фермент превращает синтетический субстрат X-gal в нерастворимое соединение синего цвета.

Плазмида pCR2.1 TOPO представляет собой сине-белую селективную плазмиду, в которой белые колонии считаются положительными для вставки. Это работает путем вставки последовательности ДНК для клонирования внутрь области, кодирующей lacZ. Имея любую встроенную ДНК, прерывающую последовательности lacZ, так что фермент теряет свою функцию (потому что он больше не правильно транслируется в бактериях). С другой стороны, отсутствие вставки означает, что lacZ снова лигирован вместе, и весь фермент получен правильно и, следовательно, может метаболизировать субстрат X-gal с образованием нерастворимого синего красителя.

Однако это имеет большой смысл, если кишечная палочка растет на чашке, не означает ли это, что по умолчанию она захватила плазмиду, потому что обладает устойчивостью к ампициллину? Как выживают голубые колонии на ампициллине, если они не захватили плазмиду?
Ген устойчивости к ампициллину закодирован на плазмиде в другой области. Каждая плазмида со вставкой или без нее содержит устойчивость к ампициллину. Каждая колония, растущая на чашке, приняла плазмиду, поэтому они выживают, но не все обязательно имеют плазмиду со вставкой.
О, понятно, значит, это тест, чтобы увидеть, слилась ли плазмида со вставкой, а не проверить, была ли плазмида успешно вставлена ​​в кишечную палочку?
Это правильно! Ведь антибиотик распространяется по всей тарелке, поэтому любая растущая бактерия уже должна иметь ген резистентности.
Как сине-белый скрининг работает при отборе кишечной палочки, поглотившей плазмидный вектор?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 1v