Мы вставили ген GFP в плазмиду Bluescript SK+, трансформировали E. coli этой конструкцией, а затем посеяли на чашку с агаром с ампициллином и X-gal для проведения сине-белого скрининга. Мы получили синие колонии и белые колонии, и обычно белые колонии считаются положительными для вставки, а синие - отрицательными для вставки. Проблема в том, что результаты, которые мы получили, на самом деле противоположны. Если мы посмотрим на планшет под УФ-светом, мы увидим, что ВСЕ синие колонии флуоресцируют, что означает, что они действительно производят GFP, а ВСЕ белые - нет!! Как бы вы это объяснили?? Спасибо
Редактировать: я подумал, что, возможно, вставка может быть в рамке с lacz', поэтому мы получаем слитые белки. Однако это не объясняет, почему мы получили белые колонии, которые не флуоресцируют.
Учитывая тот факт, что неразрезанные плазмиды отрицательного контроля дают белые колонии, кажется, что в гене lacZ в плазмиде произошли значительные мутации, в результате чего неразрезанные плазмиды стали белыми из-за инактивации гена.
Я бы посоветовал приобрести новую партию pBluescript или, если это невозможно по какой-либо причине, выполнить минипрепарат на одной из синих колоний и секвенировать ее сайт множественного клонирования, чтобы убедиться, что MCS присутствует и не мутировал, прежде чем продолжить. Если вы не собираетесь покупать новую партию плазмид, также было бы целесообразно проверить длину плазмиды с помощью гель-электрофореза.
Наиболее вероятное объяснение состоит в том, что плазмиды мутировали, и поэтому вы получаете плохие результаты на синем/белом экране.
Март Хо
Алиса
Март Хо
Алиса
канадец