Как заменить область интрона в плазмиде?

Я рассматриваю возможность работы с плазмидой pRFHUE-eGFP и хотел бы заменить интрон gpdA (который является промоторной областью eGFP) промотором из другого организма.

Какой была бы хорошая стратегия замены интрона, если у меня уже есть другой ген? Вырежу ли я фрагмент между сайтами рестрикции SalI и SmaI, а затем вставлю туда новый промотор с совместимыми концами?

введите описание изображения здесь

Ответы (1)

Ваша стратегия сработает, но, если возможно, вам лучше использовать XmaI, а не SmaI, так как последний является ферментом с тупым концом.

Кроме того, ваша стратегия не заменит всего промоутера gpdA , если это то, что вам нужно. Вы можете обратиться к их статье, где из рис. 1 видно, что область промотора намного длиннее, чем область между SalI и SmaI:

Рис. 1. из Crespo-Sempere et al. (2011)

Я высоко оценил ваши ответы по синтетической биологии! Хотите поддержать предложение по созданию специального сайта SynBio StackExchange? area51.stackexchange.com/proposals/125068/синтетическая биология
Спасибо @jakebeal, но я придерживаюсь скромного мнения, что вопросы синтетической биологии должны оставаться частью биологии SE. :)
Ваш звонок, конечно; мои собственные рассуждения изложены в area51.meta.stackexchange.com/a/32413/211190
В вашем ответе указано, что плазмида на AddGene и та, на которую ссылаются в документе, отличаются. Направленность обратная, они различаются по размеру на 8 бит, а аннотации не совпадают. Интересно, почему это может быть.
Как бы то ни было, я самообучаюсь синбио. В Интернете нет специализированных мест, где я мог бы получить поддержку (может быть, форумы diybio?). Я вижу плюсы и минусы для специализированной SE, плюс: привлечение опыта, ориентированного на синбио, в центральное место, минус: похоже, я уже получаю ответы от SE Bio.
Обратите внимание, что то, что вы здесь называете направленностью, не имеет значения: одна карта просто отображается как обратное дополнение другой. Во-вторых, аннотации могут отличаться, потому что авторы выбрали определенный словарь для статьи, тогда как карта плазмид, которую вы получили от AddGene, может быть автоматически аннотирована на основе последовательности ДНК (просто предположение). И я бы не стал обращать особого внимания на разницу в размере в 8 б.п.
Как заменить область интрона в плазмиде?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v