Каковы возможные причины получения дополнительной нераспознаваемой полосы при электрофорезе в агарозном геле?

Я провел электрофорез в 0,7% агарозном геле моего образца плазмидной ДНК, состоящего из вектора GFP, с использованием фермента рестрикции NheI и HindIII.
Я использовал два типа плазмид, т. е. выделенные методом минипреп-щелочной, и еще один, выделенный системой мидипреп (чистый) из того же источника E. coli .
Линии 4 и 5 показывают разрезанную и неразрезанную плазмиду, соответственно, выделенную с помощью системы подготовки midi.
Линии 1, 2 и 3 показывают маркер размером 500 п.н., разрезанный и неразрезанный сигнал изолированной плазмиды из минипрепарата соответственно. введите описание изображения здесьНа приложенном изображении мы обнаружили дополнительную полосу в плазмидах, выделенных щелочным методом (линии 2 и 3), но в чистых образцах (линии 4 и 5) таких дополнительных полос не обнаружено.
Каковы возможные причины результата? Как я могу интерпретировать этот результат? Если у кого-то были подобные результаты, поделитесь.

Не уверен, что это такое, но я заметил это сегодня и на геле. Он присутствовал только в плазмидах (переваренных), выращенных в DH5alpha (и отсутствовал в синем XL1). Хотя может совпадение.

Ответы (2)

Мне кажется, что это загрязнение геномной ДНК.

Что еще более важно, действительно ли это имеет значение? Я, конечно, ценю любопытство, но если вашей целью является клонирование, я бы просто продолжил, а затем сделал несколько диагностических срезов вашей плазмиды после трансформации. Вы можете четко видеть свой вектор или вставку в геле.

@SanjuktaGhosh Чем отвечать в качестве комментария, может быть, лучше написать ответ напрямую? Кроме того, это выглядит не коротким намеком, а действительно небольшим ответом, потому что, кажется, осталось не так много вещей, которые можно было бы уточнить или процитировать.
Если бы это было загрязнение гДНК, я бы ожидал увидеть гораздо больше полос...
@JoeHealey Я бы тоже, но для меня это наиболее правдоподобное объяснение такого большого фрагмента.
Тем более, что он отсутствует в так называемых «чистых» фракциях, которые предположительно являются более чистыми.

Может быть несколько вещей... только что пришло мне в голову. Без вашей векторной карты и ожидаемых размеров сказать наверняка будет практически невозможно.

Возможно, вам также придется предоставить нам дополнительную информацию об условиях инкубации и т. д.

  1. Ваша первоначальная культура, из которой вы готовились, может быть не такой однородной, как вы думаете:
    • Вы получили мутанта (возможно, в вашем сайте рестрикции в этом конкретном клоне)
    • Ваша исходная культура заражена, возможно, второй кишечной палочкой, несущей другую плазмиду.

Вероятно, это маловероятно, если предположить, что ваша молекулярная/микробиологическая методика прилична, но время от времени это случается.

  1. Неполное пищеварение. Что-то в элюате вашего первого метода экстракции, возможно, ингибировало ваши ферменты, чего не происходит в другом механизме экстракции, или вы не оставляли гидролизат на достаточно долгое время.

  2. Вы что-то упустили из реакционной смеси для одного из образцов (я обычно сначала виню себя, когда что-то идет не так, поэтому я обычно просто повторяю это, чтобы быть уверенным!)

Как неполное расщепление приводит к размеру молекулы, намного превышающей размер всей плазмиды (дорожки 4 и 5)?
Неразрезанная плазмида может иметь любую длину. Если он сверхспиральный, он будет работать дальше, чем «должен» для его размера. Если он круглый, но не суперскрученный, он будет двигаться медленнее, чем «должен», по сравнению с тем, если бы это был один линейный фрагмент, поскольку он не может легко двигаться через гель.
Каковы возможные причины получения дополнительной нераспознаваемой полосы при электрофорезе в агарозном геле?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v