Можно ли экспрессировать цистроны полицистронного фрагмента вставки в одной плазмиде?

У меня есть фрагмент вставки, который я хочу экспрессировать из pUC19 в Escherichia coli. Фрагмент вставки является подразделом более крупной последовательности оперона и содержит только два последних цистрона этого оперона.

Я планирую вставить этот фрагмент в pUC19 под контролем его единственного промотора lac. Следовательно, будет два цистрона под контролем одного промотора (что, конечно, очень похоже на то, как это будет экспрессироваться в опероне WT).

На мой взгляд, экспрессия обоих цистронов под контролем одного промотора pUC19 lac должна обеспечивать трансляцию обоих генов; как только мРНК транскрибируется, оба цистрона имеют свои соответствующие сайты связывания рибосом выше своих ORF и должны быть транслированы.

Мой вопрос: был ли у кого-нибудь опыт экспрессии полицистронных фрагментов из плазмид с использованием только одного промотора для всего фрагмента? Теоретически я не вижу каких-либо вопиющих проблем с этим, но я подумал, что спрошу, прежде чем идти дальше. В конечном счете, я предпочел бы экспрессировать оба цистрона из одной плазмиды, а не экспрессировать каждый цистрон на отдельной плазмиде.

Ваше здоровье! Исаак

Ответы (1)

Если я правильно понимаю, вы ищете вариант полицистронной экспрессии. Рассматривали ли вы возможность использования последовательностей T2A или P2A? Они исходят от вируса и по существу расщепляют полипептид на две части, так называемый саморасщепляющийся пептид Т2А. Реальный механизм ее работы заключается в том, что рибосома останавливается на последовательности и не в состоянии создать пептидную связь, эффективно перезапуская трансляцию со следующей после Т2А аминокислоты.

Конечно, вы теряете независимый контроль над экспрессией, оба продукта будут экспрессироваться на одном уровне (но деградация может быть разной).

Итак, вам следует рассмотреть возможность создания конструкции, которая выглядит примерно так:

лак : ген1-Т2А-ген2-стоп

Дело в том, что а) это может не сработать в E.coli и б) это может быть не нужно, потому что основное назначение Т2А - равный уровень экспрессии двух полипептидов. И, если ваши 2 гена большие, бактериям проще обращаться с двумя отдельными плазмидами, а не с одной, но гораздо большей.

Ааа, интересно! Хотя мне не нужен T2A; сами гены имеют свои естественные последовательности терминации транскрипции, поэтому рибосома должна быть способна «разбирать» окончание каждой ORF, разделяющей продукты. Гены прокариотические, поэтому я думаю, что натальные RBS оперонов должны работать. Я просто хотел проверить это здесь, чтобы увидеть, есть ли какие-то большие нет нет.
Гены вместе образуют гетеродимер, поэтому мне нужна равноценная экспрессия ;) спасибо за помощь. Я не знал о T2A, но это полезно знать!
ваше предположение кажется правильным. Я никогда не беспокоился об экспрессии нескольких генов, так что ладно. однако, поскольку для того, что вы описываете, есть плазмида, она должна работать: snapgene.com/resources/plasmid_files/…
никогда не занимался экспрессией нескольких генов в бактериях
pETDuet близок, но это не совсем то, чем я хочу заниматься. pETDuet требует, чтобы я разделил ПЦР-фрагмент (содержащий оба гена), чтобы каждый из двух генов был экспрессирован под одним из двух промоторов плазмиды pETDuet. В этой плазмиде два промотора и два отдельных MCS. Я хочу самовыражения только под одним промоутером.
Тем не менее, я думаю, что могу заказать pETDuet на тот случай, если одиночная экспрессия промотора из экспрессии pUC19 не сработает ;) Спасибо за помощь!
Можно ли экспрессировать цистроны полицистронного фрагмента вставки в одной плазмиде?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v