Каким образом репрессор CI может одновременно активировать и репрессировать промотор PRMPRMP_{RM}, обнаруженный в фаге λλ\lambda?

Не существует правила, согласно которому фактор транскрипции должен быть либо репрессором, либо активатором. Лямбда-репрессор (CI) на самом деле является репрессором и активатором транскрипции, в зависимости от того, где он связан и с каким промотором вы имеете в виду. Я знаю, что ваш вопрос не касается напрямую фага лямбда, но я думаю, что этот механизм лучше всего объяснить в контексте того, где он был впервые изобретен: в природе. Итак, я попытаюсь кратко объяснить, как двойная роль лямбда-репрессора позволяет регулировать его собственную экспрессию и контролировать индукцию лизогенеза.

Ген cI находится под контролем промотора PRM. Промотор PRM слаб, потому что сигма-фактор холофермента РНК-полимеразы (РНКП) имеет низкое сродство к нему. Связывание РНКП с PRM и, следовательно, транскрипция оттуда на разумном уровне требует активатора. В этом процессе также участвует другой белок, называемый Cro, который также может связывать операторы OR. Ген cro находится под контролем промотора PR. PRM не является конститутивным промотором, поскольку для него требуется активатор. Я слышал, что PR называют конститутивным, потому что он является сильным промотором и может связывать РНКП без активатора. Но в то же время он находится под контролем лямбда-репрессора. Я полагаю, это зависит от того, какое определение «конститутивного промоутера» вы используете.

Операторы OR не идентичны, и поэтому CI и Cro связывают их с разным сродством: CI имеет самое высокое сродство к OR1, за ним отдаленно следуют OR2 и OR3, в то время как Cro связывает OR3 с самым высоким сродством. Связывание (любых двух молекул) зависит как от их сродства друг к другу, так и от их эффективной концентрации. При более низких концентрациях CI может связывать только OR1 и OR2 кооперативно. То есть каждый димер лямбда-репрессора связывается с другим, образуя тетрамер, причем одна половина связывает OR1, а другая — OR2. Связывание обоих операторов в виде тетрамера обеспечивает более сильное взаимодействие. В более высоких концентрациях CI может связывать OR3. Кроме того, OR1 и OR2 расположены в промоторе PR, а OR3 — в промоторе PRM.*

Большинство лямбда-генов прямо или косвенно контролируются промоторами PR и PL (PL похож на PR, но сам промотор не принимает непосредственного участия в регуляции cI). Когда лямбда существует в виде профага, ее ДНК интегрируется в геном хозяина, и экспрессия большей части ее генов подавляется. Это требует подавления КИ PL и PR. Когда вирусная ДНК впервые интегрируется, в клетке нет CI (поскольку это фаговый ген). Экспрессия cI изначально зависит от другого промотора (PRE), но я не буду здесь вдаваться в подробности. Как только концентрация CI становится достаточно высокой, он может связываться с OR1 и OR2 в виде тетрамера. Связывание здесь физически блокирует промотор PR и предотвращает экспрессию cro (CI здесь действует как репрессор PR). Он также взаимодействует с РНКП (фактически сигма-фактором) и облегчает связывание с промотором PRM. что приводит к дальнейшей экспрессии cI. Этот процесс обычно называют рекрутированием: поскольку КИ прочно связан с ДНК и имеет некоторое сродство к РНКП, он может создавать более сильное взаимодействие между ДНК и комплексом РНКП-КИ. Проще говоря, он индуцирует промотор PRM и, таким образом, действует как активатор транскрипции cI. По мере увеличения концентрации CI он будет больше связывать OR3 (который расположен в промоторе PRM) и подавлять промотор PRM, физически блокируя связывание РНКП. Таким образом, cI может автоматически регулировать уровень своей экспрессии как положительно, так и отрицательно. он индуцирует промотор PRM и, таким образом, действует как активатор транскрипции cI. По мере увеличения концентрации CI он будет больше связывать OR3 (который расположен в промоторе PRM) и подавлять промотор PRM, физически блокируя связывание РНКП. Таким образом, cI может автоматически регулировать уровень своей экспрессии как положительно, так и отрицательно. он индуцирует промотор PRM и, таким образом, действует как активатор транскрипции cI. По мере увеличения концентрации CI он будет больше связывать OR3 (который расположен в промоторе PRM) и подавлять промотор PRM, физически блокируя связывание РНКП. Таким образом, cI может автоматически регулировать уровень своей экспрессии как положительно, так и отрицательно.

Когда лизоген находится в каком-то стрессовом состоянии, нормальные процессы хозяина приведут к протеолизу CI, и его ДНК-/сигма-связывающий домен отщепляется от доменов димера и тетрамеризации. Это означает, что CI больше не может олигомеризоваться и больше не может кооперативно связываться с OR1 и OR2. Результатом является потеря активации PRM (что приводит к значительному снижению экспрессии cI), а также потеря репрессии PR (что приводит к экспрессии cro). Затем Cro может связывать OR3 и подавлять PRM. Отсутствие репрессии PR также позволяет экспрессировать ранние фаговые гены (которые находятся под контролем PR).

Обратите внимание, что аналогичная ситуация возникает в области промотора PL, и связывание CI как с OR, так и с OL, а также октомеризация CI важны для регуляции профага, но это кажется еще более выходящим за рамки вашего вопроса. Надеюсь, вы видите, как «репрессор» лямбда на самом деле функционирует как репрессор и активатор транскрипции. Если вас интересуют такие вещи, я настоятельно рекомендую учебник «Молекулярная биология гена» Уотсона и др.

*См. комментарии. После дальнейших исследований промоторы PRM и PR перекрывают OR2 (авторегуляция и функция репрессора в бактериофаге лямбда, Ptashne et al.), Как показывает диаграмма в OP. Похоже, что область -35 как PRM, так и PR перекрывает OR2 на 2 и 3 пары оснований соответственно. Это заставило меня задуматься о том, что если CI связывается с OR2, который находится в PRM, не будет ли он физически ингибировать связывание РНКП и, таким образом, подавлять транскрипцию? Похоже, что CI взаимодействует с той же областью сигмы, которая отвечает за связывание области -35 PRM (аминокислотные замены в мотиве узнавания -35 сигмы 70, которые приводят к дефектам транскрипции, стимулируемой репрессором фага лямбда, Kuldell и Хохшильд). Таким образом, вместо того, чтобы блокировать сигма-привязку, он усиливает ее.

Мне хочется сказать: «Это сложно».

КИ действительно действует как репрессор и активатор. Регуляция транскрипции в бактериофаге лямбда довольно сложна для такой небольшой системы, поэтому некоторая путаница понятна. Льюис и др. дает приблизительное описание в относительно недавней статье ( 1 ):

Белок CI авторегулирует свой синтез. При низкой клеточной концентрации КИ КИ усиливает собственный синтез из ФРМ; при высоком уровне CI подавляет PRM (1, 8, 9). Первоначально считалось, что как положительная, так и отрицательная ауторегуляция достигается исключительно действием димеров CI на последовательность PRM-OR-PR фагового генома (1, 10) (рис. 1А), основываясь на следующих наблюдениях. (i) существует иерархия внутренней аффинности связывания димера CI с сайтами отдельных операторов: OR1 > OR2 > OR3 (11–17); (ii) CI, связанный с изначально слабым сайтом OR2, усиливается за счет кооперативных взаимодействий с CI, связанным с более сильным соседним сайтом OR1, а ансамбль из двух димеров CI в сайтах OR1 ~ OR2 репрессирует PR и активирует PRM (13, 16) (13, 16). рис. 1А); (iii) при высоких концентрациях CI димер CI может связываться с самым слабым операторным сайтом, OR3, репрессирующий PRM (1, 2) (рис. 1C). Между прочим, вторая пара димеров CI кооперативно связывается с OL1 ~ OL2 и репрессирует PL (7).

Связывание CI влияет на транскрипцию ДНК фага Lambda с помощью нескольких механизмов, включая образование петли ДНК между операторными сайтами OR на промоторах Prm/Pr и сайтами операторов OL на промоторе P1. Таким образом, поведение сконструированной системы транскрипции, полученной из фага Lambda, зависит от того, сохраняется ли возможность образования петли ДНК между этими сайтами.

Раздел обсуждения дает дополнительную экспозицию:

Наше исследование подтвердило несколько предсказаний предыдущих исследователей, обсуждавшихся выше, о механизме аутоактивации и ауторепрессии PRM путем измерения транскрипции in vitro на суперскрученных матрицах ДНК, содержащих различные комбинации операторных мутаций. Наши данные по транскрипции подтверждают модель, согласно которой аутоактивация требует связывания CI с OR2, и что активация стимулируется кооперативными взаимодействиями димер-димер и тетрамер-тетрамер между молекулами CI в OR2 и молекулами, связанными с другими операторными субсайтами. Во-первых, кооперативные взаимодействия CI происходят не только между OR1 и OR2 в цис-положении, как сообщалось ранее, но также между OR1 ∼ OR2 и OL1 ∼ OL2 в транс-положении, что приводит к заполнению отдельных участков при более низких концентрациях CI, судя по их влиянию на активацию PRM. . Для транс-кооперативности за счет образования октамера требуются соседние сайты связывания CI между OR1 ∼ OR2/OL1 ∼ OL2 или OR1 ∼ OR2/OL2 ∼ OL3, а не OR1 ∼ OR2 и OL1 ∼ OL3 (рис. S3 F и J). Аналогичная транскооперативность между OR3 и OL3 вытекает из репрессии PRM при более низких концентрациях CI. Кооперативные взаимодействия приводят к образованию петель ДНК, когда они происходят между CI в OL- и OR-сайтах. PRM ауторепрессируется связыванием CI с OR3, как сообщалось ранее (1-3), и это стимулируется взаимодействиями димер-димер и тетрамер-тетрамер, которые происходят посредством образования петель ДНК. Наши результаты согласуются с Revet et al. (18) что петлеобразование само по себе усиливает связывание CI с субоператорами (рис. 5). В нашей работе была проведена количественная оценка вклада каждого оператора в саморегуляцию.

Фу!

Если вы хотите точно смоделировать систему, описанную Huang et al., я бы очень внимательно посмотрел на последовательность цепей и определил, какие части системы фага лямбда присутствуют на самом деле. Возможно, они не приняли во внимание последние данные о регуляции промоторов Pr и Prm при обсуждении своей системы.

Ко второму вопросу: при выделении и отсутствии CI промотор Prm можно использовать в качестве конститутивного промотора ( 2 ). В таких условиях промотор Prm демонстрировал такие же скорости транскрипции, как и конститутивный промотор ptet.