Влияние делеции или вставки одного нуклеотида на отжиг праймеров

Как влияет на отжиг праймеров и, следовательно, на ПЦР-амплификацию делеция или инсерция одного нуклеотида внутри праймера?

Представьте себе такой праймер:
GCGTCATAAAGGGGACGTG (праймер),
а в соответствующей части матричной ДНК отсутствует один G, поэтому он выглядит так:
GCGTCATAAAGGGACGTG (шаблон).

Возможное сочетание может быть шаблоном
праймера GCGTCATAAAGGGGACGTG GCGTCATAAA_GGGACGTG или шаблоном праймера GCGTCATAAAGGGGACGTG GCGTCATAAAGGG_ACGTG или чем-то промежуточным.





Возможно ли полное нарушение амплификации с таким праймером в обычной ПЦР в реальном времени при отжиге 60°С? Может ли это полностью нарушить усиление?

Если бы несоответствие было похоже на замену , я был бы вполне уверен, что праймер все еще был бы функциональным, и происходила бы амплификация. В крайнем случае это будет по крайней мере остаточная амплификация на позднем Ct. Есть много данных о том, как несоответствие замен влияет на праймеры, и у меня также есть большой личный опыт в этом.

К сожалению, несоответствия удалений менее изучены, а также защищены от Google. Единственное указание, которое я нашел, это эта работа:
Lipsky RH, Mazzanti CM, Rudolph JG, Xu K, Vyas G, Bozak D, et al. Анализ плавления ДНК для обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов. Клин Хим. 2001;47:635-44.
В этой работе делеция одного нуклеотида оказывала такое же или меньшее влияние на температуру плавления, чем несоответствие замены. Но речь шла о более длинных олиго. Примеры:
Эффект делеции:
фрагмент 133 п.н., 67 % GC, делеция SNP в положении 43, дельта Tm (гомо-гетеродуплекс) = 1,2°C
Эффекты замен:
фрагмент 152 п.н., 43 % GC, замена Т на С в положении 68, дельта Tm (гомо-гетеродуплекс) = 0,9°C
Фрагмент 100 п.н., 41 % GC, замена T на C в положении 42, дельта Tm (гомо-гетеродуплекс) = 1,4°C
Фрагмент 163 п.н., 60 % GC, замена C на T в положении 86, дельта Tm (гомо-гетеродуплекс) дуплекс) = 2,2°C
Фрагмент 110 п.н., 59 % GC, замена G на A в положении 66, дельта Tm (гомо-гетеродуплекс) = 3,8°C

Вопросы :
1. Не могли бы вы порекомендовать мне литературу о том, как делеционные несоответствия внутри (не в самом конце!!!) праймеров влияют на отжиг и ПЦР?
2. Как вы думаете, будет ли праймер в моем примере все еще функциональным, по крайней мере, частично, или вы вообще не ожидаете амплификации?

РЕДАКТИРОВАТЬ после вашего ввода:
это онлайн-приложение " mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Two-state-melting " считает, что несоответствия удаления более дестабилизируют, чем замены, по крайней мере, для коротких праймеров. Для моего собственного примера он вычислил дельта Tm (гомо-гетеродуплекс) = 12,9°C. Если вместо этого я попытаюсь использовать несоответствия замещения, дельта Tm (гомо-гетеродуплекс) окажется в интервале от 3,8°C до 5,7°C.

Новый вопрос
Если у вас есть опыт, максимально похожий на мой случай, который представляет собой праймер длиной 19 нуклеотидов с делецией одного нуклеотида в комплементарной матрице в положении cca 6–9 от 3'-конца праймера, при температуре отжига 60 °C, пожалуйста, сообщите Я знаю, добились ли Вы усиления или нет. Пожалуйста, дайте мне соответствующую ссылку, если она у вас есть, чтобы я процитировал ее в своем обзоре :-) .

Кроме того, меня по-прежнему интересует общая информация, поскольку тема достаточно узкая, чтобы касаться делеций или вставок одиночных нуклеотидов в праймерах. (Не несоответствия замены).

праймеры будут функциональными, если 3'-концы правильно совпадают и несоответствие невелико. Вы можете рассчитать измененную температуру плавления с помощью сервера гибридизации ДНК-ДНК UNAfold.
Очень аккуратное приложение, спасибо! Для пользы других - я нашел, где именно входит в последовательности на сервере: mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Two-state-melting
Подобно @Chris, я использовал более длинные, даже ультрамеры, чтобы вызывать удаления. Мне было любопытно, насколько маленькими я могу сделать праймеры, но я всегда мог позволить себе роскошь делать их довольно длинными без неприятных второстепенных структур. Рассматривали ли вы возможность попробовать это на тестовом шаблоне, чтобы посмотреть, как это работает? Не будет слишком дорого, чтобы проверить (я рассматривал это).

Ответы (2)

Мы использовали этот тип праймеров для создания мутаций вне рамки или для добавления дополнительных оснований. По моему опыту, ваш PCR будет работать (вероятно, с меньшей эффективностью), и вы получите продукт с дополнительной базой. Мы использовали праймеры с большими различиями в сайт-направленном мутагенезе плазмид на основе ПЦР, где до 10 оснований не совпадали, но праймеры были также более длинными. Для несоответствия одиночных нуклеотидов (либо +, либо - одно основание) мы использовали праймеры примерно такого размера.

Что касается литературы, то эти публикации могут быть полезны:

Особенно первая публикация содержит много других интересных ссылок.

Если вас не беспокоит ваша личность, не могли бы вы прислать мне ссылку на вашу публикацию, где был праймер такого размера (около 19 нуклеотидов), имел делецию или вставку одного нуклеотида и все еще работал? (Знаю, наверное, я слишком требователен, потому что вы уже прислали мне 4 публикации. Просто было бы удобно сразу иметь ссылку на этот конкретный пример).
Ничего страшного: посмотрите на эту статью , последовательности находятся в дополнительных данных. Самые короткие пары праймеров — это 25-меры. Длина определяется окружающей последовательностью.
@Barbara Что я забыл: недавно я использовал немного более короткие праймеры (21 и 22 мера), но эти результаты еще не опубликованы.
@ Крис: Спасибо, по крайней мере, у меня есть уверенность, что это может работать таким образом. Но если вы вдруг вспомните, что у вас есть постерная презентация, где упоминаются эти короткие буквари, пожалуйста, дайте мне знать.
@ Крис снова: В статьях, которые вы перечислили, ничего не говорится об удалении одиночных нуклеотидов, за исключением Kwok 2014, в котором говорится о минимуме. (Квок говорит, что праймеры можно использовать для введения indel SNP, и их следует помещать в середину олигонуклеотида из 24-36 оснований.) В вашей собственной статье упоминаются только длинные (46 нуклеотидов) олигонуклеотиды, охватывающие 3-нуклеотидную делецию. Я что-то упускаю из виду?
Да, вы делаете. В дополнительном документе задокументировано 25 мер.
@ Крис Единственными праймерами длиной 25 нт являются N278D-F и N278D-R. Сравнение их с базой данных nrnt показывает, что N278D-F имеет центральную букву G, где у большинства мышей есть A. N278D-R имеет центральную букву C, где у большинства мышей есть T. Это похоже на несовпадения замен, а не на вставки. (Ограничение взрыва Homo sapiens не дает хороших совпадений). В каком праймере есть несоответствие indel и по какому шаблону я должен его взорвать, чтобы увидеть indel самостоятельно?
Я никогда не говорил об инделах, для этого вам понадобятся более длинные олиго. Этот короткий праймер использовали для введения точечной мутации. Судя по нашим результатам секвенирования, это сработало достаточно хорошо.
@ Крис Откуда взялась информация о том, что индели (один нуклеотид) более дестабилизируют отжиг, чем замены? (Возможно, мы используем разные определения indel и точечной мутации. Я говорил о вставках или делециях отдельных нуклеотидов. Но не заменах)
что ты имеешь в виду под индейцами? В вашем словаре делеция или вставка одного нуклеотида является подтипом indel?
Я называю эти небольшие изменения точечными мутациями (когда мы заменяем только один нуклеотид на другой, чтобы экспрессировать другую аминокислоту). В остальном я придерживаюсь определения indel, которое вы найдете в Википедии : «В исследованиях зародышевой линии и соматических мутаций indel описывает особый класс мутаций, определяемый как мутация, приводящая как к вставке нуклеотидов, так и к удалению нуклеотидов, что приводит к чистое изменение общего числа нуклеотидов, где оба изменения находятся рядом в ДНК».
Ваш ответ еще больше меня смущает. Для ясности давайте просто поговорим о мутациях со сдвигом рамки считывания , вызванных вставкой или делецией только одного нуклеотида. У вас есть цитата о праймере длиной 25 нуклеотидов (или короче), который содержит мутацию сдвига рамки считывания на основе одного нуклеотида в середине?
Я не проводил мутации со сдвигом рамки считывания, так как этого не происходит при анализе фактора транскрипции (это было бы летальным исходом для эмбриона). Что мы сделали, так это ввели точечные мутации (замену отдельных нуклеотидов на другие), и здесь могут работать относительно короткие праймеры (мутация N278D в упомянутой выше статье сделана с 25-мером).
Спасибо. Теперь, какая часть вашего основного ответа (не комментарии) относится к мутации сдвига рамки считывания на основе одного нуклеотида ? Вы раньше работали с праймером длиной около 19-22 нуклеотидов с мутацией сдвига рамки считывания на основе одного нуклеотида в середине?

Добавление еще одной ссылки. Эта группа изучает влияние различных несоответствий (например, A>T против A>G), а также рассматривает влияние позиционных эффектов.

Наши результаты показывают, что отдельные несоответствия вызывают широкий спектр эффектов, начиная от незначительных (порог <1,5 циклов, например, A–C, C–A, T–G, G–T) до серьезных последствий (порог >7,0 циклов, например, A–C, C–A, T–G, G–T). , A–A, G–A, A–G, C–C) при ПЦР-амплификации. Выявлена ​​четкая взаимосвязь между конкретными типами несоответствия, положением и воздействием.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2797725/

Меня интересовали удаления, а не замены. Неважно, как сильно это напрягает, люди продолжают присылать мне информацию о заменах на каждом форуме.
Влияние делеции или вставки одного нуклеотида на отжиг праймеров
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v