Работа с повторяющимися основаниями в ДНК?

Вы можете использовать гораздо более длинные праймеры (до 70 п.н. или около того), чтобы они охватывали повторяющуюся область, которую вы хотите изменить, и некоторую более конкретную последовательность для закрепления праймера (при условии, что ваш вектор позволяет). Если несколько сайтов, которые вы хотите изменить, находятся в пределах досягаемости друг друга, вы можете заказать праймеры с 2 или более мутагенизированными сайтами, но ожидайте, что ваша эффективность упадет. Другой вариант — провести несколько раундов мутагенеза, изменяя одну позицию за раз.

Затем я просто попробовал бы эти праймеры в градиентной ПЦР с использованием хорошего фермента, такого как Q5 от NEB. Попытка найти температуру для полосы правильного размера, вероятно, будет ключевой.

Настоящая проблема, с которой вы столкнетесь, скорее всего, не в клонировании, а в том, чтобы доказать это. Растяжки гомополимера представляют собой настоящую проблему для секвенирования, и чем длиннее они становятся, тем хуже. Автоматизированным секвенаторам трудно отличить, например, 29 аденинов от 30 аденинов подряд. Когда ваши результаты секвенирования будут возвращены, если ваша секвенирование отличается на одно или два основания, будет практически невозможно сказать, было ли неправильно ваше секвенирование или ваша конструкция.

Хорошо, одна из основных проблем с хвостами polA связана с ПЦР, которая является методом, обычно используемым в молекулярном клонировании, специфичном мутагенезе и т. д.

Одна проблема с хвостами PolyA и ПЦР связана с праймерами. Так как A имеет только 2 водородные связи вместо 3, это может затруднить разработку хороших праймеров в этой области. Если вы хотите амплифицировать эту область с помощью ПЦР, у вас могут возникнуть проблемы с созданием праймеров, поскольку рекомендуется, чтобы у вас было много G и C (особенно ближе к концам для стабильности). Таким образом, создание тупых концов, мутагенез и т. д. будет более трудным.