Недавно я столкнулся с проблемой после трипсинизации своих стабильно трансфицированных СНО-клеток. Когда я добавляю среду, чтобы смыть клетки со дна колбы, обычно остаются большие куски клеток, которые я почти не могу ресуспендировать должным образом... Я также пытался увеличить время инкубации с трипсином, но это не очень помогло. .
У кого-нибудь есть решение для этого? Я использую ту же партию трипсина, что и обычно, и тем временем я также разморозил 2 разных запаса замораживания, но у меня все еще есть та же проблема.
Я также пробовал разные пипетки, от 25 до 5 мл. Но я могу пипетировать, как маньяк, вверх-вниз, вверх-вниз... но вокруг плавают большие куски клеток...
У Gibco есть агент против слипания, проверенный для клеток CHO, как и у Lonza, но мне больше нравятся реагенты Gibco. Клетки склонны к скоплению по ряду причин, включая внеклеточную ДНК из лизированных клеток и присутствие ионов Ca и Mg (ионов, важных для клеточной адгезии и агрегации).
Вы можете попробовать это:
1) Промойте и ресуспендируйте в сбалансированном солевом растворе без магния или кальция. Как сбалансированный солевой раствор Хэнка.
или
2) Лечите ДНКазой I. Я думаю, вы можете снизить дозировку до 1 МЕ/мл в течение 30 минут-1 часа, чтобы разорвать изрядное количество комков ДНК. Вы можете сделать это в базовой среде (такой как RPMI, DMEM и т. д.) или в сбалансированном солевом растворе. Ваша среда может содержать сыворотку, только если сыворотка была инактивирована нагреванием, поскольку протеазы в сыворотке инактивируют вашу ДНКазу. Инкубируйте с ДНКазой при осторожном встряхивании при 37°C (для этой цели у меня всегда был ротатор пробирок в инкубаторе, просто поместите ваши клетки в коническую емкость на 50 мл и включите их для перемешивания в течение 1 часа. Вы также можете использовать шейкер с подогревом). Если у вас нет этой настройки, вы можете перемешивать при комнатной температуре, но, возможно, немного дольше.
и возможно
3) Один из других очевидных вариантов — избежать пассирования слипшихся клеток и собрать остальные. Вы можете сделать это, поместив все свои клетки в колбу, в т.ч. комки, встряхните на мгновение и дайте постоять, чтобы куски быстро упали на дно, и соберите все, кроме того, что упало на дно.