Мы пытаемся выяснить, влияет ли увеличение или уменьшение концентрации кальция в цитоплазме на взаимодействие двух белков, используя ко-IP в клетках HEK293T в качестве считывания.
На различных форумах и в статьях я обнаружил, что для повышения уровня цитоплазматического Ca2+ в невозбудимых клетках используются три основные категории соединений. Ионофоры (A23187, иономицин), агонисты передачи сигналов InsP3-PKC (карбахол, АТФ) и ингибиторы SERCA (тапсигаргин, CPA).
Однако разные документы и разные люди используют разные концентрации и продолжительность лечения. Поскольку многие лекарства вызывают довольно кратковременные спайки, я понимаю, что время здесь имеет решающее значение. Поскольку у нас нет ресурсов для оптимизации визуализации красителей, чувствительных к [Ca2+], мне также интересно, существует ли более простой способ приблизительной оценки [Ca2+], возможно, путем анализа маркерного белка/РНК с помощью вестерн-блоттинга или КПЦР?
Большое спасибо!
Насколько мне известно, микроскопия (будь то с красителями вроде флюора или с геномно-кодируемыми индикаторами кальция) — действительно ваш единственный хороший выбор, особенно для получения количественной чувствительности, а я думаю, это то, что вам нужно. Изменения в цитозольном кальции невероятно динамичны как во времени, так и в пространстве, что следует учитывать, когда вы спрашиваете, как кальций влияет на ваши два белка.
Мне известен пример, когда исследователи переносили клетки в буферы с различной концентрацией Ca2+ и пропитывали их мягким детергентом для повышения уровня кальция (Borges-Pereira et al 2015). Я не уверен, что это сработает для вашей системы, но на это стоит взглянуть, так как я думаю, что это поднимает уровни довольно мягко и стабильно, и вы лучше представляете, какой будет ваша внутриклеточная концентрация, не визуализируя напрямую. это. Учитывая, что вы не сможете определить концентрацию Ca2+ в любой момент времени без микроскопии, такие вещи, как SOCE и скорость внутриклеточного хелирования, могут быть важны, поэтому вам следует следить за тем, когда после лечения вы начнете свой анализ, возможно, попробовав несколько разных моментов времени
Надеюсь, это было чем-то полезно!