Насколько предсказуемо, что РНК-полимераза не будет транскрибировать повторяющиеся последовательности?

Я работаю над (дорогой) синтетической конструкцией, в которой есть много «повторяющихся» последовательностей, которые являются неотъемлемой частью ее функции. В первую очередь меня беспокоят две последовательности:

  • Длинный полиА (около 15 нуклеотидов).
  • Последовательная последовательность из двух нуклеотидов: GGGUUUGGUUGU и т. д.

Я слышал от многих об ужасах транскрипции, через которые они прошли из-за похожих последовательностей с похожими нуклеотидами. Тем не менее, некоторые советуют расшифровать это не должно быть проблемой.

Насколько предсказуемо может РНК-полимераза транскрибировать такие последовательности в E.coli ?

Ответы (2)

Я не думаю, что повторяющиеся последовательности внутренне проблематичны для кишечной палочки . Бактерии также имеют дело с такими вещами, как полиаденилирование . По сути, вы ничего не теряете, если попытаетесь — кишечная палочка является одной из наиболее надежных платформ экспрессии, и трудно предсказать, свернется ли последовательность в какую-то третичную структуру (которая может легко помешать трансляции).

Так что я думаю, что предсказуемость должна быть установлена ​​на базовом уровне частоты ошибок РНК-полимеразы кишечной палочки , которая составляет примерно 10 − 5 .

Да, транскрипция полиА-последовательности будет ненадежной: при 15-кратном повторении одного и того же нуклеотида частота ошибок транскрипции будет огромной.

Например, для E. coli в этой статье http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC331007/ приводится некоторый порядок ошибок транскрипции, вызванных повторами нуклеотидов. По их данным, для серии 11 А (настолько короче вашей) более трети транскриптов со сдвигом рамки (удалением или вставкой одного нуклеотида).

Кроме того, у вас могут быть проблемы посерьезнее, чем ошибки транскрипции: ваша конструкция также будет чрезвычайно подвержена мутациям со сдвигом рамки. Например, согласно данным на рис. 3 из http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22991466 , путем экстраполяции на серию 15 А можно ожидать, что коэффициент делеции выше 10^-2 на базу. пара в поколениях. Поскольку у вас есть 15 целевых нуклеотидов, это означает, что более 10% клеток будут иметь мутацию сдвига рамки считывания, что приведет к тому, что ваш ген не будет функционировать.

У меня нет данных для «Последовательной последовательности двух нуклеотидов».

Добро пожаловать в Биология SE! Ваш ответ приветствуется, но мы предпочитаем более подробные ответы, в которых все объясняется, утверждения поддерживаются ссылками. Простое размещение ссылок на статьи не обязательно является лучшей практикой (хотя это хороший способ поддержать ваши претензии). Пожалуйста, уточните свой ответ, обработав документы, на которые вы ссылаетесь, извлеките из них полезную и актуальную информацию, используйте свои слова, цитируйте, если необходимо. Не стесняйтесь посетить наш справочный центр, чтобы ознакомиться с рекомендациями по размещению хороших ответов. В таком виде это скорее комментарий, чем полноценный ответ.
Я не уверен, почему «Это не дает ответа»? Я отредактировал сообщение, чтобы добавить больше точности, но мой ответ остается прежним: полиА-последовательность из 15 нуклеотидов является проблемой, если она «неотъемлема от [] функции», как говорит автор.
Я видел документы по доставке мРНК, которые создают свою мРНК с использованием плазмиды, содержащей до 150 As на 3'-конце гена, поэтому им не нужно добавлять хвост посредством отдельной ферментативной реакции. Однако нахождение на 3'-конце, вероятно, предотвратило бы проблемы со сдвигом кадра. Я не знаю, как они помещают As в плазмиду, я пытался заказать олигонуклеотид ДНК размером 100 A в IDT, чтобы попробовать добавить его в плазмиду, но они не смогли бы синтезировать ничего длиннее, чем 30 As в плазмиде. строка.
Комментарий @AliceD был до того, как вы отредактировали свой ответ, который выглядел намного лучше!
Отличный ответ. +1 спасибо за редактирование. Написать ответ и ответить на вопрос — это еще кое-что здесь, в Bio.SE :)
Насколько предсказуемо, что РНК-полимераза не будет транскрибировать повторяющиеся последовательности?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v