Насколько значительна деградация РНК при удалении кэпа/полиА у эукариот или НТР у прокариот?

Вопрос довольно очевиден, но разделен на две части. Я пытаюсь использовать систему репрессии, которая использует расщепление РНК в определенных областях с помощью рибозимов с целью их деградации (или просто инактивации).

Этот сценарий кажется более вероятным у эукариот, поскольку они имеют кэпированные 5'-UTR и полиА-хвосты на 3'-UTR, которые обеспечивают стабильность РНК. Как быстро и в какой степени будет деградировать некепированная РНК? А как насчет отсутствия хвоста полиА?

Поскольку у прокариот нет этих структур, я ограничен использованием областей UTR в моем конкретном случае. Существует ли какой-либо подобный механизм, общий или для конкретных белков, который позволит мне использовать область UTR для инактивации РНК у прокариот? Пожалуйста, имейте в виду, что добавление синтетических последовательностей к этим областям UTR, безусловно, возможно.

Вы можете использовать рибопереключатели. Было показано, что малые РНК влияют на стабильность РНК и у прокариот, но я думаю, что они играют стабилизирующую роль, в отличие от эукариот.
ПолиА-хвост у бактерий выполняет иную функцию, чем у эукариот, у бактерий полиА-хвост, по-видимому, запускает деградацию РНК, а не предотвращает ее. Я никогда не пытался трансформировать бактерии с помощью мРНК, но я вводил много мРНК мышам, а колпачок и хвост имеют решающее значение для экспрессии, если они отсутствуют, РНК обычно расщепляется слишком быстро, чтобы обнаружить белок, по крайней мере, в мой анализ биолюминесцентной визуализации.

Ответы (1)

Удаление 5'-кэпа необходимо для деградации экзонуклеазами 5'→3', такими как Xrn1/2. Xrn1/2 является конститутивным, и деградация некепированных РНК будет довольно быстрой (точное время жизни не указано). Деаденилирование обычно предшествует деградации 3'→5' экзосомой, но я не уверен, является ли это обязательным условием. Однако бесхвостые мРНК можно стабилизировать, привязав Pab1p (белок, связывающий поли-А) к 3'UTR. См. этот документ.

Рисунок 4 связанной статьи.

    Рисунок-4

Привязанный Pab1p стабилизирует мРНК, которые не имеют хвоста. (Стратегия. Саморасщепляющийся рибозим HDV встраивали в 3'-UTR РНК MFA2/MS2, получая мРНК без поли(А)-хвоста (А0) in vivo. (B) Хроматография на олиго(dT) целлюлозе. РНК экстрагировали из клеток, несущих рибозимсодержащую конструкцию, изображенную на А, или контрольную плазмиду, использованную на предыдущих фигурах. РНК фракционировали с помощью хроматографии на олиго(dT) целлюлозе, затем анализировали с помощью Нозерн-блоттинга. РНК, содержащая рибозим, не удерживается колонкой, в то время как контрольная РНК сохраняется. (T) Общая РНК до фракционирования; (+) удерживается колонкой; (-) не удерживается колонкой. мРНК работает немного быстрее в образце с сохраненным (+) олиго(dT), чем в тотальном (T) РНК, поскольку на дорожку загружено меньше РНК. (C) Анализ нуклеазы S1. 3'-конец мРНК, полученной из штамма, несущего рибозимсодержащую РНК, определяли с помощью нуклеазного картирования S1. Показано положение нерасщепленного зонда (65 нуклеотидов) и защищенных видов (43 нуклеотида). Видный 3'-конец находится в ожидаемом положении расщепления рибозимом. (D) Распад расщепленной рибозимом РНК с помощью транскрипционного импульсного эксперимента и Нозерн-блоттинга. Скорость оборота репортерных мРНК, расщепленных рибозимом, определяли в штаммах с (слева) или без (справа) MS2/Pab1p. Время (в минутах) после репрессии транскрипции указано непосредственно вверху; периоды полураспада находятся внизу. (E) Количественная оценка результатов. Количество мРНК нормализовали к уровню 18S рРНК внизу каждой дорожки на D. (•) MS2/Pab1p; (○) только вектор.

Прокариотические UTR не имеют какой-либо общей парадигмы. Для контролируемой инактивации мРНК в прокариотической системе можно использовать рибопереключатели или цис-репрессивные РНК (комплементарные РНК RBS). РНК-управляемая деградация РНК также возможна у прокариот, использующих систему CRISPR-Cas. См. этот документ. Для этой активности необходимы белки Cmr-1, 2, 3, 4 и 6.

Насколько значительна деградация РНК при удалении кэпа/полиА у эукариот или НТР у прокариот?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v