Оптогенетика - Как работают микробные опсины?

Нет ничего особенного в использовании родопсина по сравнению с экспрессией в клетке любого трансгена. Тогда этот вопрос можно прочитать так:

Каков процесс, при котором клеточная популяция нацеливается и имплантируется интересующему гену?

Есть много способов, которые зависят от конкретного типа клеток и от того, хотите ли вы сделать это in vitro , in vivo и у каких видов, и было бы очень сложно подробно объяснить их все здесь, поэтому я ограничусь два подхода, которые популярны при проведении оптогенетики у грызунов: вирусная инфекция и трансгенез.

Вирусная инфекция использует инактивированный вирус для доставки трансгена. По сути, вы создаете фрагмент ДНК с геном интересующего бактериального опсина и помещаете его в оболочку вируса , то есть ряд белков, формирующих «тело» вируса и содержащих его генетический материал.
Затем вы вводите вирус в нужную зону (например, в определенное ядро ​​мозга) и ждете, пока он заразит клетки вокруг места инъекции. Через неделю эти клетки будут экспрессировать трансген.

По (по крайней мере, я так думаю) историческим причинам первым типом вирусов, используемых для этого подхода, были лентивирусы. Однако с ними немного сложнее обращаться (особенно потому, что для них требуются специальные помещения, где с ними можно безопасно работать), поэтому аденоассоциированные вирусы (AAV) становятся все более и более популярными.

Обратите внимание, что вирус инактивирован, то есть не может размножаться, просто заражает клетки вокруг места заражения, но и распространяться вокруг не сможет. Это делается как из соображений безопасности, так и потому, что вы хотите, чтобы заражение было ограничено конкретным регионом, в который вы ввели вирус.

Как я уже говорил, вместо того, чтобы вводить бактериальный опсин, вы можете вставить любой интересующий ген, процедура та же самая. Что касается опсинов, первыми двумя, которые были использованы, были каналродопсин-2 ( ChR2 ), канал, чувствительный к синему свету и который можно использовать для деполяризации (= возбуждения) клеток, и галородопсин ( NpHR ), чувствительный к хлоридной помпе. к желтому свету, который, наоборот, гиперполяризует (= подавляет) клетки.
В настоящее время существуют десятки вариантов этих и других опсинов, которые можно использовать для управления клеточной активностью с помощью света. Многие из них описаны в этом (осторожно! Довольно техническом) обзоре:

Оптогенетика в нейронных системах - Ижар и др., Нейрон, 2011 г.

Вместо этого трансгенез работает путем создания животного, несущего опсин (или любой другой ген) в своей ДНК. Это можно сделать различными способами, например, путем микроинъекции эмбриональных стволовых клеток, несущих трансген.

Вы можете найти довольно подробное объяснение этого процесса здесь: Transgenic Cells and Gene Knockouts , хорошо подытоженное на этом рисунке (взятом на той же странице):

Поколение трансгенных мышей http://9e.devbio.com/images/ch02/wt020302-2.jpg

Но как добиться селективности по типу клеток ?
Перед геном опсина вам также придется поставить другую последовательность, называемую промотором. Промотор представляет собой последовательность, специфичную для каждого гена и используемую для определения того, какие гены клетка будет или не будет транскрибировать. Например, промотор гена, кодирующего белок, присутствующий только в мышцах, будет использоваться мышечными клетками, но не нейронами. Вы даже можете получить более конкретную информацию, например, используя промоторы, типичные для подмножества клеток, а не для других (например, глутаматергические нейроны используют другой набор промоторов, чем ГАМКергические нейроны, хотя эти два набора будут, по крайней мере частично, перекрываться). . Однако это означает, что если вы хотите изменить тип клеток, над которым работаете, вам придется изменить используемый вектор ДНК.
Обычно используемый подход, чтобы избежать этого, заключается в использовании Cre-зависимых векторов (обратите внимание, что это можно использовать как для вирусных инфекций, так и для трансгенных животных).
По сути, у вас будет линия мышей, которая экспрессирует белок, полученный из фага P1 , называемый рекомбиназой Cre , только в интересующем типе клеток (опять же, с использованием специфического промотора). Cre обладает свойством разрезания ДНК рядом со специфическими последовательностями длиной в 34 пары оснований, называемыми loxP (с последовательностью ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT). По существу, если у вас есть loxP-[some sequence in the middle]-loxPрекомбиназа Cre, она обрежет последовательность в середине, оставив только последовательность loxP.
В настоящее время коммерчески доступны сотни различных линий Cre-экспрессирующих мышей, нацеленных на множество различных типов клеток в различных органах.

Теперь вам просто нужна конструкция, которая позволит вам экспрессировать опсин Cre-зависимым образом. Это то, что было сделано группой Hongkui Zeng и описано в этой статье:
набор инструментов Cre-зависимых оптогенетических трансгенных мышей для индуцированной светом активации и молчания. - Мэдисен и др., Nat. Неврологи. 2012

Не вдаваясь в подробности, идея состоит в том, чтобы фланкировать последовательность STOP двумя сайтами loxP. Это блокирует транскрипцию (это то, что делает последовательность STOP), если не присутствует Cre-рекомбиназа.

По сути:

Источник : я сам, лицензия CC-by-sa , не стесняйтесь использовать его повторно .

Обратите внимание, что на схеме ROSA26 является вездесущим промотором, то есть промотором, используемым всеми клетками, поэтому в данном случае специфичность определяется экспрессией рекомбиназы Cre, а не промотором данной конструкции. Кроме того, вводят флуоресцентный репортер (например , GFP ), чтобы иметь возможность визуализировать, где экспрессируется опсин.

Скрещивая этих мышей с Cre-линиями по вашему выбору, вы можете затем экспрессировать опсины в интересующем вас типе клеток.