Я изучаю ядерный белок и хочу составить список потенциальных белков, с которыми он взаимодействует. Из ядерной фракции клеток 293T я сделал IP (иммунопреципитацию), чтобы получить белок, и отправил все, что я получил, на масс-спектральный анализ. Я также сделал IP с неспецифическим антителом в качестве контроля. У меня огромный список хитов, и я не знаю, как расставить приоритеты. Я могу вручную удалить хиты, которые также пришли с неспецифическими антителами, это, очевидно, просто липкие белки. Я просмотрел Pubmed в поисках способов расставить приоритеты неколичественным масс-спектрометрам, но я не уверен, что какой-либо из них сработает в моем случае. Все они требуют многократного повторения масс-спектров — я могу сделать это, если мне нужно, но мне нужен способ более разумно взглянуть на мои исходные данные.
Если они доступны, поговорите с людьми, которые анализировали ваши данные. Использование их знаний разумно.
Я предполагаю, что два важных шага завершены. Во-первых, что ваши результаты были найдены правильно. Я также предполагаю, что идентификация пептидов и белков была отфильтрована, чтобы обеспечить коэффициент ложного обнаружения 1:100 на каждом уровне.
Вы можете удалить все белки, которые были идентифицированы в вашем контроле аффинной очистки. Другим вариантом является использование репозитория загрязняющих веществ для аффинной очистки (CRAPome), который обеспечивает формальную основу для удаления загрязняющих белков. Это хороший ресурс, если ваши данные совместимы.
Остальные белки — это то, с чем вам придется работать, это
список потенциальных белков, с которыми взаимодействует [ваш белок].
Расставьте приоритеты для этих белков, исходя из биологии вашей экспериментальной системы. Если список небольшой, проработайте функцию каждого белка и оцените, насколько она соответствует биологии, которую вы исследуете.
Чтобы оценить потенциальные функциональные связи между белками, вы можете создать сеть in silico . Марковская кластеризация может подчеркнуть наличие функционально различных групп белков в сети. Строка, указанная выше, может это сделать. Меры центральности могут указывать на присутствие белков, которые могут влиять на поведение сети.
Для больших списков вы также можете оценить функцию белков в списке, выполнив анализ обогащения функциональных аннотаций. Есть много других вещей, которые вы могли бы сделать, но главная цель — сохранить биологию в авангарде ваших усилий.
Наконец, вы упомянули, что повторы необходимы. Анализ данных занимает много времени. Если это был тестовый запуск, убедитесь, что тест прошел успешно, а затем запустите реплики. Время, потраченное на анализ неполных данных, может быть потрачено на завершение набора данных или обеспечение сбора правильных данных. Количественные данные могут быть очень полезными, и при осторожном подходе к протеомике дробовика можно получить количественные данные, но когда требуются количественные данные, необходимо консультироваться с людьми, управляющими машиной.
Вы можете искать самые распространенные белки в своем образце. Хотя, как вы говорите, ЖХ-МС анализ вашего IP был неколичественным, вы все же можете попытаться получить количественную оценку. Чтобы уточнить, вы можете использовать, например, покрытие последовательности, нет. ПСМ для каждого белка, шт. пептидов, идентифицированных для белка, доля идентификатора спектра и т. д. в качестве косвенных показателей распространенности.
Между обилием белка и всеми этими количествами существует грубая корреляция. Если белка больше, вы, скорее всего, будете иметь большее количество пептидов, идентифицированных из него, больше нет. назначенных ему PSM, он будет иметь более высокий охват последовательности и т. д. Разные люди используют разные вещи. Я часто использовал нет. PSM, нормированные по длине белка, как оценка распространенности этого белка.
Как уже упоминалось, обсудите с людьми, которые проанализировали ваши данные. Как показывает опыт, я бы сначала отфильтровал свои данные по 1% FDR на уровне PSM, затем на уровне пептидов, а затем на уровне белков. Тогда я бы выбросил все белки, которые не были идентифицированы хотя бы двумя уникальными пептидами. Затем я сравнивал белки, идентифицированные в списке отрицательного контроля, и удалял общие идентификаторы. Затем отсортируйте оставшийся список по номеру. PSM для каждого белка. Это дало бы оценку более распространенных белков в образце IP. Например, ваш белок-приманка (белок, против которого вы делали IP) должен быть самым распространенным белком в вашем образце. После этого можно предположить, что белки взаимодействуют с вашей приманкой.
Помните, что это не правильный количественный способ измерения белок-белковых взаимодействий с помощью аффинной очистки в сочетании с ЖХ-МС. Но это полезное начало. Я всегда использовал предварительную информацию из такого анализа для разработки лучших. Кроме того, прочитайте о взаимных IP-адресах, чтобы подтвердить взаимодействие.
Майкл_А
Чарли Паркер