Я читаю журнальную статью , где анализируют протеом синаптосом. В этой статье они выделяют синаптосомы из гиппокампа мышей. Я знаю, что синаптосомы содержат полный пресинаптический терминал вместе с постсинаптической мембраной и постсинаптической плотностью.
Я пытаюсь понять протокол субклеточного фракционирования, который они использовали для выделения синаптосом в разделе материалов и методов.
Я знаю, что синаптосомы выделяют из субклеточного фракционирования гомогенизированной ткани. Чего я не понимаю, так это того, что подразумевается под «фракцией сырой мембраны P2». Мне интересно, что именно представляет собой эта сырая мембранная фракция P2, потому что именно из этой фракции выделяют синаптосомы (посредством центрифугирования в градиенте плотности сахарозы).
Я читал другие статьи , в которых они также изолировали синаптосомы. Однако в этих статьях также упоминается, что они гомогенизируют мозговую ткань и выделяют синаптосомы из сырой мембранной фракции P2.
Любые советы приветствуются.
Первый результат Google, который я получаю по поисковому запросу «грубая мембранная фракция P2», — это статья 2014 года с заголовком «Подготовка синаптической плазматической мембраны и белков постсинаптической плотности с использованием прерывистого градиента сахарозы» . Он включает пошаговый протокол; Я опубликую наиболее важные шаги здесь:
- Низкоскоростное центрифугирование для удаления ядерной фракции (получается супернатант S1)
Центрифугируйте гомогенат в роторе с фиксированным углом при 900 xg в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант (S1) в новую маркированную пробирку на 13 мл и ресуспендируйте осадок ядерной фракции (P1) в 500 мкл 0,32 М HEPES-буферной сахарозы. ПРИМЕЧАНИЕ. Фракция (P1) может храниться при температуре -80 ° C и использоваться для вестерн-блоттинга ядерной фракции.
- Обогащение сырой синаптосомной фракции (выход гранул P2)
Центрифугируйте супернатант (S1) при 10 000 xg в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия. Удалите супернатант (S2) и зарезервируйте 500 мкл в микроцентрифужной пробирке для хранения при температуре -80 градусов по Цельсию для последующего количественного определения белка и вестерн-блоттинга цитозольной/световой мембранной фракции. Ресуспендируют оставшийся осадок сырой синаптосомной фракции (P2) в 1 мл 0,32 М HEPES-буферного раствора сахарозы, а затем добавляют еще 3 мл 0,32 М HEPES-буферного раствора сахарозы.
Центрифуга при 10 000 мкг в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия. Удалите супернатант (S2 ') и зарезервируйте 500 мкл в микроцентрифужной пробирке для хранения при температуре -80 градусов по Цельсию для последующего количественного определения белка и вестерн-блоттинга цитозольной/световой мембранной фракции. Сохраните промытый сырой синаптосомный осадок (P2') в полипропиленовой трубке.
Таким образом, S и P относятся к надосадочной жидкости и осадку после центрифугирования соответственно. P1 и S1 - из первого цикла центрифугирования; осадок P1 содержит клеточное ядро, а супернатант S1 переходит к следующим этапам. Второй цикл центрифугирования дает P2 и S2. P2 содержит синаптосомы, а также другой мембранный материал, который необходимо будет удалить как S3 на более поздних этапах.