Отбор LacZ: голубые колонии, несмотря на лигирование вставки

Было высказано предположение, что бактерии, трансформированные вектором pBlueScript, содержащим вставку в середине гена lacZ', все еще могут давать синюю окраску на X-gal, если вставка небольшая и лигирована внутри рамки с геном lacZ' (источник : мой курс, ResearchGate ).

Я не понимаю, как возможно, что трансляция не заканчивается на стоп-кодоне, закодированном вставкой. Это как-то связано с дырявым окончанием? Более того, даже если бы дырявая терминация была возможна, это означало бы, что ВСЕГДА существует вероятность 1 из 3 того, что вставка окажется внутри кадра.

Транскрипция не останавливается на стоп-кодоне.
@canadier Спасибо! Но почему это не так? А также, если он не останавливается на стоп-кодоне, не означает ли это, что в 1 из 3 случаев вставка будет лигирована в рамку, и анализ не будет работать?
Транскрипция не имеет ничего общего с кодонами. Возможно, вы имели в виду перевод?
@canadianer Ой, это неловко! Да, это то, что я имел в виду!

Ответы (1)

Большинство вставок нарушают экспрессию бета-гал (путем смещения рамки считывания и введения стоп-кодонов) и, следовательно, устраняют ферментативную активность, необходимую для расщепления X-гал и получения синего цвета.

Ваш источник согласен с вами - вставка стоп-кодона остановит трансляцию (не транскрипцию) и сохранит белый цвет.

Спасибо! Но источник также сообщает, что «в редких случаях, когда вставка очень мала и не нарушает рамку считывания, активность бета-галактозидазы будет проявляться даже в рекомбинантных клонах, поэтому сине-белый скрининг становится неактуальным». Я неправильно интерпретирую это?
Я понимаю, что для сохранения активности бета-галактозидазы вставка не должна иметь стоп-кодона. Я думаю, что это разумно, потому что случай стоп-кодона явно рассматривается в предыдущем абзаце.
Но не означает ли это, что без стоп-кодона синий цвет будет даваться в 1 из 3 случаев (вероятность внутрирамочного лигирования) и анализ бессмысленный, так зачем кому-то его так использовать?
Вставка не должна нарушать укладку белка, кроме того, что она маленькая, не имеет стоп-кодона и находится в рамке считывания.
@mxwsn Вы должны добавить это к своему ответу.
Отбор LacZ: голубые колонии, несмотря на лигирование вставки
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v