Передача сигналов через рецепторы, связанные с G-белком?

ОТРЕДАКТИРОВАННЫЙ ОТВЕТ

Основываясь на комментариях и ответах, полученных моим первоначальным ответом на этот вопрос, я решил отредактировать ответ и ответить на некоторые вопросы.

Поскольку я работаю с белками, я предпочитаю подходы, основанные на белках, особенно когда меня интересует наличие белка. Это просто так, потому что белок является важным функционально (здесь я говорю только о проблемах / вопросах, связанных с белком, и не говорю здесь о материалах РНК-интерференции), так что, как я знаю, опытные редакторы требуют для большинства статей, они хотят видеть какой-то белок Работа. Теперь я знаю, что это не всегда возможно, поскольку антитело (Ab) может быть не очень специфичным или чувствительным, особенно к белкам с низкой экспрессией. Если белок очень временный, это еще больше усугубляет проблему. вот почему многие люди прибегают к экспрессии мРНК, чтобы сделать дедуктивное обоснование присутствия белков, хотя это делает ряд предположений о том, как обрабатывается мРНК, и является ли связь между экспрессией мРНК и уровнем экспрессии белка линейной, но это другое обсуждение. Итак, все, что я пытаюсь сказать, это то, что важно проверять наличие белка с использованием методов, основанных на антителах, таких как иммуногистохимия (IHC) и вестерн-блоттинг (WB).

Таким образом, моя основная рекомендация состоит в том, чтобы использовать антитела, специфичные для видов Gi и Gs (не перекрестно реагирующие), для проверки наличия интересующих вас белков и всегда использовать контроль тяжелой цепи антител для IHC и отрицательный контроль для вашего WB с использованием образца, который вы know не выражает интересующие вас белки, если это возможно. IHC также сообщает вам некоторую пространственную информацию, а также информацию о том, присутствуют ли G и Gi в одной и той же клеточной линии или нет, и локализованы ли они совместно и т. д. и т. д.! Очевидно, проверьте наличие антител и их совместимость для процедур IHC или WB.

Другой метод, который осуществим, заключается в том, что если вы знаете, что ваши две разные клетки экспрессируют только один из G или Gi исключительно, вы можете посмотреть на их специфические ингибиторы и добавить их к некоторым из ваших клеток, и есть вероятность, что если доза достаточно высока, это приведет к гибели клеток, поскольку G или Gi имеют решающее значение для функционирования клеток. Вы, вероятно, можете избежать подобных экспериментов, используя лунки в 24-луночной чашке, поэтому вам не нужно использовать столько среды или лекарств. Но с такими вещами это может не сработать, и вы можете получить нецелевые эффекты, поэтому просто сделайте это в качестве дополнительного теста. Для вашего теста на наркотики всегда делайте контроль ДМСО, так как есть вероятность, что наркотики растворены в нем, а если нет, просто используйте любой растворитель, в котором растворены наркотики, и добавляйте их в свои клетки в своих контрольных экспериментах.

Теперь другой возможный и широко используемый метод проверки экспрессии гена белка и последующего вывода о его присутствии в виде белка заключается в использовании ПЦР на основе обратной транскрипции, такой как ОТ-ПЦР, хотя она не обязательно должна быть в реальном времени, поскольку правильно указано в комментариях. Обратите внимание, что я совсем не эксперт в этом и проверяю свой ответ в этом разделе, так как я лично не проводил ПЦР на основе обратной транскрипции. Насколько мне известно, основная процедура заключается в извлечении клеточной мРНК, которую можно выполнить с помощью таких наборов, как RNeasy или аналогичный продукт (я не рекламирую здесь какие-либо продукты, и это только то, с чем я столкнулся!) . Протоколы поставляются с наборами и доступны онлайн, и точно сообщает вам, какое минимальное/максимальное количество клеток/уровни РНК должны присутствовать и как ваши клетки должны быть (осаждены) перед обработкой. Другой метод выделения РНК — CsCl, но он довольно запутанный и сложный и требует большого опыта, чтобы сделать это правильно, но я знаю, что это неизбежно в определенных ситуациях, но для обработки клеток подойдет набор. По крайней мере, протокол RNeasy утверждает, что он обогащает мРНК и выборочно исключает другие типы РНК. Получив клеточную мРНК, вы можете приступить к обратной транскрипции, используя правильно разработанные праймеры для интересующего вас гена с помощью термоциклера. Опять же, я не уверен, какие инструменты использовать для разработки праймеров для создания кДНК из мРНК и на что обращать внимание (кроме того факта, что ваши праймеры должны быть специфичными), поскольку я провожу только обычную ПЦР, но буду рад любым изменениям! Как только вы перейдете от мРНК к кДНК, вы можете запустить их на своем агарозном геле (на основе бромистого этидия или любого другого окрашивания ДНК) и посмотреть, присутствует ли ваш ампликон и имеет ли он правильный размер (опять же на основе выбранных вами праймеров, которые вы бы знали каков правильный размер) и, следовательно, выражен ли ваш ген или нет. По крайней мере, в наборе RNeasy говорится, что вам не нужно использовать расщепление ДНКазой, чтобы избавиться от какой-либо ДНК перед обратной транскрипцией вашей мРНК, поскольку большая часть ее очищается при использовании набора, но у вас есть такая возможность. Теперь, что касается секвенирования РНК следующего поколения, я ничего о них не знаю, поэтому снова приветствовал бы любые изменения, но это кажется ненужным, поскольку вы только хотите знать, выражен ли интересующий ген, поэтому не нужна информация о последовательности, но это тоже вариант (хотя я себе дороговато?). Просто упомянем об очень очевидном: важно, чтобы виды, из которых были получены ваши линии, были секвенированы, или у вас есть хорошая информация о последовательности генов Gs и Gi в ваших линиях, иначе разработка праймеров будет делом догадок. Всегда лучше узнать, сделал ли кто-нибудь то, что вы пытаетесь сделать, и попросить их праймеры, так как большинство людей с удовольствием делятся реагентами.

Теперь вы, наверное, уже заметили, что мои методы довольно смещены в сторону подходов молекулярной биологии, и это просто потому, что я больше знаю об этом, однако отличным предложением было использовать уровни цАМФ в качестве индикатора экспрессии G или Gi. Опять же, я не эксперт в этом, так как я никогда не анализировал маленькие молекулы, но я полагаю, что это включает что-то вроде ВЭЖХ, которую вам нужно обсудить с химиком / биохимиком, как извлечь и очистить ваши клетки от всего и оставить только цАМФ. Вероятно, для этого есть процедура/набор/биосенсор, но я не буду вдаваться в подробности, так как практически ничего об этом не знаю. Однако у меня есть предостережение для таких типов косвенных экспериментов. Я понятия не имею, что представляют собой ваши клеточные линии и насколько хорошо они охарактеризованы, но, поскольку в линиях есть все виды мутаций, делеций и вставок, не стоит делать выводы по уровням цАМФ. Поскольку наличие цАМФ очень важно для клеточной функции, их абсолютные уровни в клеточной линии не обязательно являются хорошим индикатором того, присутствует ли один регулятор продукции цАМФ или нет, и я уверен, что если вы сделаете что-то подобное, вы откроете себя для основных критика любым редактором/рецензентом журнала. Что будет хорошей идеей, хотя в любых будущих экспериментах, которые вы проведете с этими клетками, так это сверхэкспрессировать G или Gi и увидеть их влияние на выработку цАМФ, но я просто не рекомендую использовать уровни цАМФ в качестве единственного индикатора того, является ли G или Gi выражено или нет. Делать выводы по уровням цАМФ — не лучшая идея. Поскольку наличие цАМФ очень важно для клеточной функции, их абсолютные уровни в клеточной линии не обязательно являются хорошим индикатором того, присутствует ли один регулятор продукции цАМФ или нет, и я уверен, что если вы сделаете что-то подобное, вы откроете себя для основных критика любым редактором/рецензентом журнала. Что будет хорошей идеей, хотя в любых будущих экспериментах, которые вы проведете с этими клетками, так это сверхэкспрессировать G или Gi и увидеть их влияние на выработку цАМФ, но я просто не рекомендую использовать уровни цАМФ в качестве единственного индикатора того, является ли G или Gi выражено или нет. Делать выводы по уровням цАМФ — не лучшая идея. Поскольку наличие цАМФ очень важно для клеточной функции, их абсолютные уровни в клеточной линии не обязательно являются хорошим индикатором того, присутствует ли один регулятор продукции цАМФ или нет, и я уверен, что если вы сделаете что-то подобное, вы откроете себя для серьезных критика любым редактором/рецензентом журнала. Что будет хорошей идеей, хотя в любых будущих экспериментах, которые вы проведете с этими клетками, так это сверхэкспрессировать G или Gi и увидеть их влияние на выработку цАМФ, но я просто не рекомендую использовать уровни цАМФ в качестве единственного индикатора того, является ли Gs или Gi выражено или нет. их абсолютные уровни в клеточной линии не обязательно являются хорошим индикатором того, присутствует ли один регулятор продукции цАМФ или нет, и я уверен, что если вы сделаете что-то подобное, вы подвергнете себя серьезной критике со стороны любого редактора/референта журнала. Что будет хорошей идеей, хотя в любых будущих экспериментах, которые вы проведете с этими клетками, так это сверхэкспрессировать G или Gi и увидеть их влияние на выработку цАМФ, но я просто не рекомендую использовать уровни цАМФ в качестве единственного индикатора того, является ли Gs или Gi выражено или нет. их абсолютные уровни в клеточной линии не обязательно являются хорошим индикатором того, присутствует ли один регулятор продукции цАМФ или нет, и я уверен, что если вы сделаете что-то подобное, вы подвергнете себя серьезной критике со стороны любого редактора/референта журнала. Что будет хорошей идеей, хотя в любых будущих экспериментах, которые вы проведете с этими клетками, так это сверхэкспрессировать G или Gi и увидеть их влияние на выработку цАМФ, но я просто не рекомендую использовать уровни цАМФ в качестве единственного индикатора того, является ли Gs или Gi выражено или нет.

Если ничего не помогает, а вы устали и хотите отмыть руки от этой задачи по идентификации, вы всегда можете лизировать свои клетки и отправить их на масс-спектрометрию (МС), если такая возможность есть в вашем институте. Крайне важно, чтобы виды, от которых происходят ваши линии, были охарактеризованы с точки зрения их глобальных белковых последовательностей, поскольку такие программы, как Mascot, запрашивают необработанные спектральные данные по базам данных, таким как UniProt, для получения белкового покрытия и последующего совпадения белков. Кроме того, прежде чем приступить к экспериментам с РС, просто поговорите с управляющим предприятием и попросите совета относительно того, какой буфер для лизиса лучше всего подходит для лизиса ваших клеток, и какие компоненты не должны быть в вашем буфере для лизиса, а также насколько чувствительны их машины и как вероятно, вы должны получить обнаружение и то, что ваша концентрация белка должна быть. Я думаю, что лучше всего использовать машину Orbitrap, и, как правило, чем выше количество белка, тем больше вероятность, что вы его обнаружите. Поскольку клеточный лизат довольно грязный, а колонки МС-машины могут насытиться обильными белками, такими как актин, было бы лучше запустить ваши лизаты на геле SDS-PAGE в восстановительных условиях (вы даже можете выполнять несколько загрузок, запуская свои образцы в гель, выключив машину WB, загрузив больше образцов и пропустив их в гель, и продолжайте делать это несколько раз Это работает, я сделал это сам, но для вытянутых образцов, которые немного чище (меньше загрязняющих веществ / нежелательных белков). ) в целом). Как только ваш гель пройдет, просто вырежьте область геля, соответствующую молекулярной массе Gs и Gi, и отправьте ее на идентификацию MS. Этот метод (пропускание вашего лизата через гель SDS-PAGE) избавляет от нежелательных белков, которые могут мешать процессу идентификации. Но MS очень дорого!

Опять же, я очень приветствовал бы любые изменения в моем собственном отредактированном ответе! Я здесь, чтобы помогать и учиться.

Без экспериментов слишком сложно и дорого, вам не нужно это делать.

Возьмите, пометьте образцы, затем примените лиганды и средства к существованию. Ингибитор будет иметь более медленную скорость роста , а не смерти, и будет использовать контроль с повторениями. Также, если у вас есть деньги, купите epac FRET для измерения цАМФ. Найдите кого-нибудь, кто сделает FRET, если вы не можете. Это займет больше дня, но вы избежите всего, что я дал ему слишком много, он все равно умрет. Если вы изначально не разделяли свои клеточные линии по белкам и имеете смесь Gs-Gi в клеточных линиях, и вам нужно найти, какой лиганд вызывает доминирующий ответ, вам придется провести эти тесты для отдельных лиц. Есть компании, специализирующиеся на реагировании на рост.

Если не ЛАД. Найдите какой-нибудь бизнес с торрентом ION и секвенируйте геном , это действительно очень дешево. Если ваши белки имеют известную гомологию с G или Gi, это даст наилучшие результаты быстрее. Если у вас новая функция белков, добавьте лиганды, и у Gi будет меньше ПЦР-ампер, чем у G. Не делайте свою собственную экстракцию АН, просто позвольте им. Я видел так много образцов, которые испортились при доставке, потому что люди пытались сэкономить.

Кроме того, поскольку у вас возникли проблемы с планированием этого эксперимента, найдите компанию, которая проведет весь эксперимент за вас. В большинстве мест с торрентами ION есть целая лаборатория для проведения такого эксперимента, и они делают это еженедельно.