Почему при секвенировании по Сэнгеру мы прибегаем к клонированию? Почему ПЦР недостаточно?

Я понимаю, что при секвенировании по Сэнгеру мы можем клонировать наши фрагменты с помощью, например, бактерий, чтобы сделать несколько копий наших фрагментов для дальнейшего анализа.

Я также понимаю, что клонирование может быть узким местом в секвенировании по Сэнгеру, что отчасти послужило толчком к развитию методов NGS.

Но разве ПЦР не делает именно это, делает несколько копий?

Что мне не хватает?

Возможный дубликат секвенирования из ПЦР
@MarchHo: но... этот вопрос не о Сангере :-|
В некоторых случаях вы не знаете, какую последовательность ищете — функциональное клонирование, геномные проекты, клонирование ДНК/РНК, связывающее интересующие вас белки и т. д.
Кроме того, с помощью ПЦР можно амплифицировать любые последовательности, имеющие последовательности праймеров на обоих концах. Иногда вы не уверены, что получите правильную последовательность из сырых смесей ДНК.
На это невозможно ответить, не зная контекста того, что вы пытаетесь упорядочить. Но как человек, секвенировавший буквально тысячи экзонов геномной ДНК, очевидно, что клонирование не требуется для каждого отдельного проекта Сэнгера. Я только что использовал ПЦР для амплификации нужных мне участков.

Ответы (2)

Частота ошибок ПЦР по-прежнему очень высока по сравнению с репликацией ДНК природных бактерий ее плазмид.

Репликация ДНК природных бактерий имеет частоту ошибок примерно 1 на 10 миллиардов , а лучшая коммерчески доступная ПЦР-полимераза (Q5 от NEB) имеет частоту ошибок примерно 1 на 1 миллион .

Таким образом, клонирование фрагментов в бактерии и секвенирование клонированных плазмид гарантирует, что у вас будет правильная последовательность для дальнейших последующих экспериментов, поскольку частота ошибок при репликации естественных плазмид намного ниже. При использовании ПЦР у вас, вероятно, возникнут некоторые ошибки из-за более высокого уровня ошибок. Это становится все более и более вероятным с увеличением числа циклов ПЦР, а также увеличением длины ампликона ПЦР.

Тот факт, что последовательности ампликона ПЦР правильные, не означает, что ДНК, клонированная из ампликона ПЦР, является правильной. Поэтому, если ПЦР предназначена для последующих экспериментов, лучше секвенировать клонированную плазмиду, а не ампликон.

Кроме того, как указал WYSIWYG в комментарии , клонирование ампликона ПЦР в плазмиду также позволит использовать области плазмиды, фланкирующие сайт клонирования, для секвенирования. Это позволяет использовать стандартные праймеры для секвенирования на плазмиде вместо разработки новых праймеров для секвенирования для каждого ампликона ПЦР.

Более того, поскольку для секвенирования по Сэнгеру требуется, чтобы праймеры связывались примерно на 50–100 п.н. выше области, подлежащей секвенированию, клонирование ампликона в плазмиду также позволило бы секвенировать короткие ампликоны за одно чтение, вместо того, чтобы требовать прямого и обратного чтения для секвенирование ампликона ПЦР.

Это неправильно; или, по крайней мере, это только отчасти правильно. Это правда, что ПЦР имеет гораздо более высокий уровень ошибок, чем бактериальная репликация. Но это не является серьезной проблемой при секвенировании объединенной ДНК в результате реакции ПЦР, потому что, хотя каждая амплифицированная цепь может иметь ошибки, среднее значение амплификации остается исходной последовательностью, потому что только небольшая часть цепей имеет конкретную ошибку в конкретное место. Однако, если вы сначала амплифицируете ДНК с помощью ПЦР, а затем клонируете ее и секвенируете, у вас будет худшее из обоих миров, потому что у вас вполне могут быть ошибки в клонированном фрагменте.
@iayork Хотя верно то, что прямое секвенирование продукта ПЦР выполнимо и часто выполняется, подавляющее большинство клонирования выполняется для переноса фрагмента ДНК в вектор для какой-либо экспрессии. Если вы секвенируете продукт ПЦР перед его клонированием, вам нужно будет секвенировать его снова после этого, так как существует риск того, что отдельный клонированный фрагмент окажется неправильным. Вместо этого имеет смысл секвенировать известный одиночный клон. Насколько мне известно, секвенирование продуктов ПЦР обычно проводится либо для проверки того, что ПЦР сработала, либо для секвенирования коротких участков ДНК в длинных векторах.
Я думаю, у вас довольно ограниченное представление о секвенировании; Я использую ПЦР для целей секвенирования с 1992 года, и я далеко не одинок. В любом случае, исходный пост не спрашивал, как клонировать, они спрашивали, есть ли техническая причина для клонирования в отношении секвенирования по Сэнгеру. Нет ни одного; секвенирование с помощью ПЦР дает очень точную последовательность, и ваше объяснение частоты ошибок вводит в заблуждение.
@iayork Я добавил ряд технических причин для клонирования. Я бы посчитал это вескими причинами для секвенирования клонированной плазмиды вместо прямого ампликона ПЦР.
Однако вы все еще не исправили свой вводящий в заблуждение комментарий о частоте ошибок ПЦР.
@iayork Я не считаю количество ошибок вводящим в заблуждение. Цель состоит в том, чтобы показать, что ПЦР производит ошибки в нетривиальной пропорции ампликонов, что делает необходимым секвенирование ряда клонов, полученных из ампликона, если вы хотите получить безошибочный продукт для последующих экспериментов. Что касается вашего собственного ответа, одно «стандартное и простое решение» проблемы ошибок в ампликонах ПЦР состоит в том, чтобы клонировать и секвенировать их.
Да, но ты упускаешь суть. Секвенирование продукта ПЦР не показывает ошибок. Это проблема только в том случае, если вы хотите клонировать продукт. Первоначальный вопрос заключается в том, нужно ли вам клонировать, чтобы секвенировать. Вы отвечаете: «Вы должны клонировать, потому что, если вы не клонируете, то при клонировании возникают проблемы». Серьезно, это очень простые вещи.

Вы можете использовать продукты ПЦР в секвенировании по Сэнгеру; это очень распространено. Использование продуктов ПЦР вместо клонированных генов вызывает ряд проблем, которые менее важны, чем в случае с клонированными последовательностями, например наличие неполных или неправильных продуктов ПЦР, но для большинства этих проблем существуют стандартные и простые решения.

И другие незначительные проблемы, такие как возможная необходимость клонирования, возможность использования стандартизированных праймеров для секвенирования после клонирования (например, T7) и т. д.
Почему при секвенировании по Сэнгеру мы прибегаем к клонированию? Почему ПЦР недостаточно?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v