Подготовка геномной библиотеки: почему фермент рестрикции не врезается в ген?

В настоящее время я пытаюсь глубже понять создание геномной библиотеки. В большинстве учебников, которые я читал (как и в википедии), упоминалось, что геномная библиотека создается путем выделения ДНК и ее фрагментации с помощью специфического фермента рестрикции, который режет примерно столько раз, сколько существует генов. Однако на самом деле это не может работать, не так ли?

Допустим, E. coli имеет 4000 генов с 4 600 000 п.н.геном. Это означает, что теоретически я должен генерировать фрагменты длиной более 1150 п.н. (если каждый ген имеет одинаковую длину и нет других последовательностей). Это означало бы, что мне нужен фермент рестрикции, который сокращается примерно в 4000 раз, создавая фрагменты размером более 1150 бит/с. Поэтому я бы использовал рестриктазу с сайтом распознавания 5 пар оснований (режет каждые 1024 бита) или с 6 парами битов (режет каждые 4096), конечно, только если пары оснований случайны. Теперь вы уже видите, что с помощью первого рестриктазы я (даже в теории) прорежу многие гены, а со вторым я могу получить гены подходящего размера, но фрагментирую и другие. Кроме того, гены, особенно у более сложных организмов, расположены неравномерно, а могут быть сконцентрированы в одних областях, а в других расположены просто повторяющиеся последовательности. Так почему же во всех учебниках упоминается, что я могу создать полную геномную библиотеку с помощью одного фермента рестрикции? Не было бы более разумно разрезать множество копий ДНК случайным образом, как это делается при секвенировании дробовиком, чтобы получить более широкий охват? Итак, мой вопрос: как ДЕЙСТВИТЕЛЬНО подготовить геномную библиотеку, ничего не зная о последовательности? Вы просто принимаете во внимание, что многие гены будут обрезаны посередине и надеетесь на лучшее? Это кажется очень странной стратегией амплификации полных генов. как ДЕЙСТВИТЕЛЬНО готовится геномная библиотека, ничего не зная о последовательности? Вы просто принимаете во внимание, что многие гены будут обрезаны посередине и надеетесь на лучшее? Это кажется очень странной стратегией амплификации полных генов. как ДЕЙСТВИТЕЛЬНО готовится геномная библиотека, ничего не зная о последовательности? Вы просто принимаете во внимание, что многие гены будут обрезаны посередине и надеетесь на лучшее? Это кажется очень странной стратегией амплификации полных генов.

Спасибо! :)

Ответы (1)

Геномная библиотека создается с целью инкапсуляции полного генетического компонента организма.

Вы делаете это, фрагментируя геном с помощью фермента рестрикции, который разрезает его распознаваемую последовательность. Эти фрагменты затем берутся и клонируются в плазмиду , чтобы затем их можно было секвенировать внутри плазмиды с использованием общих последовательностей, которые находятся на плазмиде, но не (как правило) в самом организме. Секвенирование традиционно выполняется секвенированием по Сэнгеру , которое имеет ограничение на длину последовательности, которую вы можете сделать за один раз — действительно хорошее секвенирование даст вам ~ 1000 п.н., а качество последовательности упадет примерно после 600 п.н.

Геномная библиотека не предназначена для экспрессии — как только гены идентифицированы, их можно субклонировать в экспрессионную плазмиду, чтобы посмотреть, что они делают. Так что для этой цели разрезать ген на фрагменты не проблема, так как вы найдете остаток на другой плазмиде и сможете реконструировать полноразмерный ген, взяв два фрагмента и собрав их.

Причина, по которой вы используете рестрикционный фермент, заключается в том, что последовательность, которую он разрезает, также используется для встраивания его в плазмиду.

Итак, в этот момент вы можете спросить себя, как вы сопоставляете концы генов (или любую последовательность, если уж на то пошло), когда все они разрезаны идентичной последовательностью?

Что ж, ответ заключается в том, что вы используете несколько рестрикционных ферментов, либо по отдельности, либо в комбинациях, чтобы получить множество фрагментов, разрезаемых в разных местах. Это будет означать, что как только вы создадите библиотеки из этих разных расщеплений, вы сможете упорядочить разные библиотеки и найти, где фрагменты перекрываются, а затем собрать все последовательности вместе в исходную последовательность.

Например, если вы посмотрите на картинку ниже. Если вы представите, что черные ящики — это один и тот же ген, а верхний — разрезанный рестриктазой А, а нижний — В, вы увидите, что два рестриктазы генерируют перекрывающиеся фрагменты, поэтому, если вы секвенируете фрагменты из обоих рестриктазами, вы можете найти, где концы в A совпадают с другими в A, посмотрев на фрагменты в B.

введите описание изображения здесь

Спасибо!! Таким образом, я предполагаю, что геномные библиотеки в основном используются для секвенирования, тогда как библиотеки кДНК используются для экспрессии (поскольку вы всегда получаете полный ген), что имеет смысл. Это действительно смутило меня, так как во многих «общих» учебниках объясняется, что создание геномной библиотеки используется, например, для поиска гена, который я связал с «они хотят экспрессировать этот ген позже». Я не совсем понял, зачем тебе фрагментированный ген. Но я думаю, что это имеет больше смысла сейчас. Спасибо!
@ФеликсХ. Если этот ответ касается вашей проблемы , подумайте о том, чтобы принять его , нажав на галочку слева от ответа, сделав его зеленым. Это помечает вопрос как решенный к вашему удовлетворению и присуждает репутацию как вам, так и человеку, который ответил. Если у вас >= 15 очков репутации, вы также можете проголосовать за ответ, если хотите. Обязательств тоже нет.
Подготовка геномной библиотеки: почему фермент рестрикции не врезается в ген?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v