Поиск комбинации шаблон/олигонуклеотид для моего первого эксперимента с ПЦР

Я инженер по информационным технологиям. Я люблю биологию, поэтому я исследую биологические темы и интересуюсь ПЦР. Вот почему я решил создать машину ПЦР.

Теперь все сделано, и я хочу провести свой первый эксперимент, чтобы увидеть, работает он или нет. Я был бы очень рад, если бы кто-нибудь мог дать мне какие-либо предложения для тестирования его дома. Какой олиго следует использовать для тестирования самым простым способом? Я имею в виду шаблонную ДНК для тестирования, которую легко найти и извлечь.

Ответы (3)

Вам нужен не слишком сложный геном, который предполагает что-то микробное. Вам также нужен хорошо охарактеризованный геном: либо полностью секвенированный, либо с большим количеством секвенированных генов, чтобы вы могли создавать праймеры. И, наконец, вам нужен легкодоступный источник материала для выделения ДНК.

Я бы предложил либо сухие дрожжи, как источник ДНК Saccharomyces cerevisiae , либо живой йогурт, как источник ДНК Lactobacilli. Вы даже можете попробовать культивировать что-то из йогурта, чтобы получить чистые бактериальные колонии: поскольку они будут из источника пищи, риск должен быть минимальным.

Вы можете соблазниться одним из традиционных растительных источников ДНК (например, луком), но может быть сложно избежать совместной очистки полисахаридов, которые ингибируют связанные с ДНК ферменты.

Наконец, если вы культивируете некоторые бактерии или даже используете сухие дрожжи, вам, вероятно, вообще не понадобится готовить ДНК. ПЦР прямо из бактериальных клеток широко используется - этап при 95°С высвобождает достаточное количество ДНК.

добавлено позже в ответ на комментарий OP

Я решил следить за Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus , потому что я снова и снова замечал это в отношении йогурта. Если бы вы протестировали ряд йогуртов, я думаю, вы могли бы быть достаточно уверены, что это будет присутствовать.

Существует 5 опубликованных геномов различных штаммов вида Lactobacillus delbrueckii , включая подвиды bulgaricus (различные штаммы) и lactis . Насколько они разные? Я решил посмотреть на один ген, и лактатдегидрогеназа показалась мне логичным выбором (она производит молочную кислоту).

Полная нуклеотидная последовательность гена лактатдегидрогеназы из Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842 находится здесь . Если вы запустите BLAST с этой страницы, ограничив поиск Lactobacilli (taxid 1578), вы действительно найдете совпадения с геном из нескольких других геномов. Вот репрезентативный выбор от выравнивания последовательности до наименее похожего из совпадений:

Query  99766   CCTTCCACGCTTCTGGAGGTACTGAATTCGCCCTGGCTCAACTGGGCAACGATGCCGGTA  99825
               ||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||
Sbjct  90616   CCTTCCACGCTTCTGAAGGTACTGAATTCGCCCTGGCCCAACTGGGCAACGATGCCGGTA  90675

Query  99826   TGTACGGTGCCGTTAAGATGGTTCTGTAATTTTGAATGTAAAAAAGCACCAGGCTTTTAA  99885
               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||| |||||||
Sbjct  90676   TGTACGGTGCCGTTAAGATGGTTCTGTAATTTTGAATATAAAAAAGCACCAGACTTTTAA  90735

Query  99886   AGTCTGGTGCtttttttGTTTATCCTAAAGAGTCCAGGGTTGCCTTTATCGTCGCGGCTG  99945
               |||||||||||| |||||||||| |||||||||||||||||||||| |||||||||||||
Sbjct  90736   AGTCTGGTGCTTATTTTGTTTATTCTAAAGAGTCCAGGGTTGCCTTCATCGTCGCGGCTG  90795

Query  99946   AGGCCCGCATCTTGGCCAATTCGCTGTCATTTAACGGCAATTCCAGTACGTGGCTGATCC  100005
               ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| |
Sbjct  90796   AGGCCTGCATCTTGGCCAATTCGCTGTCATTTAACGGCAATTCCAGCACGTGGCTGATTC  90855

Query  100006  CTTGTCCGTTGATGATGGCCAGGGTGCCCAGGTAGATCTCATCCTTGATCCCGTATTCCC  100065
               |||| |||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  90856   CTTGCCCGTTGATGATGGCCAGGGTGCCCAGATAGATCTCATCCTTGATCCCGTATTCCC  90915

Query  100066  CGTGCAATGGTGCGGAAAGAGGCAGGGCCAGGTCGTTGTTTTCCAAAATGGCCGTCACGA  100125
               |||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||
Sbjct  90916   CGTGCAATGGCGCGGAAAGAGGCAGGGCCAGGTCGTTGTTTTCCAAAATGGCCGCCACGA  90975

Query  100126  TCTTGGCCAGCATCATGGCCACGCCATAGTAGGTTGCGCCCTTTTTGACGATAATCTCGC  100185
               |||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| |||| |||||||
Sbjct  90976   TCTTGGCCAGCATCATGGCCACGCCATAGTAGGTCGCGCCCTTTTTGCCGATGATCTCGC  91035

Как видите, есть некоторые различия, но не должно возникнуть проблем с созданием праймеров, соответствующих обоим (опять же — это только одна часть гена). Очевидно, вы могли бы захотеть сделать выравнивание для всех 5 последовательностей, но у меня сложилось впечатление, что по крайней мере некоторые из остальных были идентичны запросу, даже если они из разных подвидов. Это очень близкие организмы.

Что касается вашего эксперимента, я предлагаю вам использовать ряд йогуртов и/или закусок в качестве источника шаблона. Вы даже можете смешивать их, если есть ограничения на вашу настройку.

Здравствуйте, большое спасибо. Живой йогурт - хорошая идея. Итак, мне нужно культивировать Lactobacilli из йогурта, чтобы получить чистые бактериальные колонии перед ПЦР, или мне просто нужно провести ПЦР прямо из живого йогурта?
Я бы беспокоился, что что-то в йогурте может ингибировать ПЦР. У вас есть центрифуга? Может быть, попробовать разбавить немного йогурта, а затем получить клеточный осадок. Это похоже на отправную точку .
Или вы можете купить закваску для йогурта - может быть чище.
Я не могу быть уверен, что покупаю лактобациллы того же типа, потому что продавец не знает научного названия бактерии. Существуют десятки видов Lactobacilli, поэтому я беспокоюсь, что мне нужно разработать много праймеров.
"У вас есть центрифуга? Может быть, попробуйте разбавить немного йогурта, а затем получить клеточный осадок". Можете ли вы рассказать больше об этом методе, я никогда раньше не использовал центрифугу, но я могу ее создать. Как узнать, где находятся бактерии в пробирке после центрифуги (обычно она находится на дне?) и как рассчитать подходящее число оборотов в минуту?
@Đức UltraSoft Наверное, лучше сейчас задать новый вопрос.

Хороший проект. Чем ваша машина отличается от этого термоциклера с открытым исходным кодом ?

Поскольку вы, вероятно, заказываете пару олигонуклеотидов ДНК (праймеров), я бы заказал еще пару олигонуклеотидов ДНК, которые будут работать в качестве вашего шаблона.

Что-то вроде этого:

oligo 1, primer forward. 5'-AAAAAAAAAAA-3'->
oligo 2, template        3'-TTTTTTTTTTTNNNNNNN[...]NNNNNNNNNNCCCCCCCCCC-5'
oligo 3, template        5'-AAAAAAAAAAANNNNNNN[...]NNNNNNNNNNGGGGGGGGGG-3'
oligo 4, primer reverse                                <--3'-CCCCCCCCCC-5'

Это просто для того, чтобы дать вам представление о том, что фактические последовательности должны быть длиннее, иметь одинаковое содержание GC% и одинаковое t-плавление. Преимущество заключается в том, что вы снижаете сложность и практически не используете ингибиторы ПЦР.

Вам также понадобится немного ДНК-полимеразы. Возможно, вы сможете одолжить аликвоту у кого-нибудь, работающего в биологической лаборатории.

Что ж, замечательная идея! Но 4 олиго могут стоить больше, чем 2 олиго, потому что мне нужно отправить олиго из другой страны, поэтому цена является важным фактором в моем эксперименте. В любом случае спасибо за эту идею. Я нахожу другой способ, более простой, чем тот, когда ДНК можно найти в любом живом организме.
Я думаю, что мой ПЦР-аппарат дешевле, быстрее, особенный, потому что я использую двигатель, чтобы поднять пробирку с 95°C до 65°C всего за несколько секунд. Если вам нравится мой PCR, я продам его вам дешевле, чем OpenPCR ;)
Я отредактировал свой ответ: вы можете провести ПЦР с двумя олигонуклеотидами без какого-либо другого шаблона ДНК. Это самый простой способ, я думаю.
@ Алан, спасибо, я удалил из ответа. Заполните, не будет полезно проверить термоциклер.
Здравствуйте, почему вы удалили отредактированный ответ? Это выглядит как хорошая идея, возможно ли это, если я использую только 2 олиго 3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAAA-5' и 5'-TTTTTTTTNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'?
да, это можно сделать с помощью двух олигонуклеотидов.. но лучше не использовать последовательности низкой сложности, такие как AAAAA и TTTTT и т. д.
Используя только два самоотжигающихся олигонуклеотида в качестве праймеров и шаблона, вы просто заполните их без амплификации. Реакция будет происходить даже без термоциклирования, что делает использование термоциклера бесполезным. Возможно, это худший эксперимент, который когда-либо проводился для проверки термоциклера :-) Спасибо @Alan Boyd за указание на это. Кстати, олигонуклеотиды обычно отправляются лиофилизированными при комнатной температуре в небольших пробирках внутри обычных конвертов, заказ 2 или 4 не повлияет на стоимость доставки.

Вы в любом случае будете откуда-то получать праймеры и ферменты. Лучшим вариантом будет получить плазмиду в любой биолаборатории. Большинство плазмид имеют специфические последовательности, такие как последовательность промотора M13 , последовательность терминатора/промотора T7 и т. д. Это стандартные последовательности, полученные из вирусов, которые обычно используются в качестве сайтов связывания праймеров для секвенирования. Кроме того, эти праймеры довольно стандартны и оптимизированы для простой ПЦР, и вы можете легко их получить.

Я полностью с этим согласен, но ОП сказал: «шаблон ДНК для тестирования, который легко найти и извлечь » (выделено мной)
Поиск комбинации шаблон/олигонуклеотид для моего первого эксперимента с ПЦР
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v