проблема секвенирования ДНК

Прежде всего, позвольте мне начать с описания проблемы:

В вашей лаборатории разработан метод исследования репликации ДНК в клеточном экстракте. К экстракту клеточного белка вы добавляете нуклеотиды, небольшое количество меченого радиоактивным изотопом 32P-dGTP, чтобы помочь визуализировать синтезированную ДНК, и линейную двухцепочечную молекулу ДНК из 4000 пар оснований, которая содержит точку начала репликации в середине. После того, как реакция протекала в течение 30 минут при 30°C, вы кипятите смесь для денатурации белков и нитей ДНК, разделяете компоненты на акриламидном геле и обнаруживаете продукты ДНК с радиоактивной меткой. Эта полная реакция показана на дорожке 2 геля на рисунке ниже.

Проблема А:

Вы выполняете анализ самостоятельно в первый раз, когда в лаборатории никого нет. В пробирке с надписью «Смесь нуклеотидов» достаточно только для одной реакции, но вы найдете пробирку с этикеткой «dATP, dTTP, dGTP, dCTP» и используете ее во второй реакции. Вы обнаружите, что первая реакция выглядит как дорожка 2, а вторая реакция — как дорожка 3. Почему во второй реакции ДНК не синтезировалась?

Мой ответ:

Потому что трифосфаты дезоксирибозы не имеют группы –ОН для присоединения. По сути, вы не можете строить с ними.

Проблема Б:

Ваш партнер по лаборатории недавно выделил мутантный штамм, который может нормально реплицировать свою ДНК при 30°C, но не проявляет репликации ДНК при 40°C. Он называет мутанта tsr1, что означает «репликация, чувствительная к температуре». Штамм дикого типа эффективно размножается при обеих температурах. Вы считаете, что можете использовать биохимический анализ клеточных экстрактов, чтобы определить, какие гены дефектны у мутанта. Вы выращиваете клетки дикого типа и клетки tr1 при 40°C, делаете экстракты, инкубируете реакцию репликации ДНК при 40°C и обнаруживаете продукты на геле. Вы наблюдаете закономерность, показанную на дорожках 4 и 5. Вы настолько взволнованы результатами, что бежите к своему партнеру по лаборатории и сообщаете ему, что знаете, какой фермент дефектен. Он в восторге от ваших результатов, но говорит, что есть три разных фермента, которые могут объяснить ваши результаты. Кто они такие?

Я 100% потерял на этом.

Из рисунка я понимаю, что дикий тип при 40 градусах имеет 4000 нуклеотидов, поэтому он не обрезается. Мутант trs1 разрезается на два фрагмента по 2000, а один из этих фрагментов разрезается на фрагменты по 500? Я правильно это понимаю? Я тоже не понимаю, почему линия 500 такая толстая по сравнению с остальными?

Во всяком случае, я чувствую себя действительно смущенным по этому поводу. Я изучал секвенирование по Сэнгеру, и это имеет 100% смысл с добавлением ddXTP в смесь для просмотра длины каждой последовательности и, следовательно, для чтения последовательности, но я даже не уверен, что это то, что здесь происходит.