Сколько полос агарозного геля характерно для кольцевой ДНК?

У меня нет на это рук, но я не удивлюсь, если суперскрученная ДНК мигрирует на разные расстояния в соответствии с какой-то внутренней топологической конформацией (т. е. более или менее скрученная И/ИЛИ более или менее надрезанная). Точно так же на этом изображении выделено> 8 конформаций. То, что проходит в геле, представляет собой циклическую ДНК фага с некоторой степенью запутывания из-за циклизации (во всем остальном ДНК фага является линейной).

Рисунок из: Arsuaga et al. 2005 г., PNAS 102 (26) 9165-9169 ( бесплатно в PubMed Central )

Другая теоретическая возможность состоит в том, что две или более плазмиды разного размера были выращены в одном и том же максипрепарате из-за некоторой контаминации. Но в этом случае вы заметите проблему еще и в пищеварении, так что, похоже, это не ваш случай.

Джанпаоло прав, что вы видите разные конформации кольцевой ДНК.

Выращивание плазмид в бактериях дает 3 основные формы: расслабленную, спиральную и суперспиральную.

• Расслабленный имеет тенденцию работать немного выше ожидаемого размера, потому что он не может так же эффективно проходить через агаразу;
• Свернутый мигрирует немного дальше ожидаемого размера, потому что он немного компактнее и поэтому мигрирует легче;
• Сверхспиральный, самый компактный, мигрирует гораздо дальше ожидаемого размера.

По вашей картинке я бы сделал следующий вывод:

1. Что разрезы HindIII эффективны и линеаризовали почти всю вашу плазмиду.
2. BamHI режет, но не так эффективно, как HindIII, в течение (предположительно) такого же количества времени. Это следует переваривать дольше, если это действительно важно переваривать только с помощью BamHI, но для диагностических целей это нормально. Я говорю это из-за слабых полос, наблюдаемых на участках ~4,5 и ~3,7 т.п.н., которые, вероятно, представляют собой спиральную и суперспиральную плазмидную ДНК соответственно.
3. Судя по вашим линейным дайджестам, размер плазмиды составляет 6 кб.
4. Глядя на непереваренную контрольную плазмиду, ваш метод мини-подготовки не является чистым и выглядит загрязненным, возможно, геномной ДНК. Кроме того, вы видите намеки на полосатость в отдельных дорожках дайджеста. Это было сделано с помощью тризола?
5. Я ожидаю, что полоса в 10 т.п.н., возможно, будет релаксированной формой плазмиды, при этом большая часть плазмидной ДНК существует в суперскрученной конформации.

Если это важные образцы, я бы рассмотрел возможность их очистки более чистыми методами, например, с помощью колонки.

Я думаю, что все эти ответы упустили наиболее вероятное объяснение нескольких полос в неразрезанном образце. Я согласен с тем, что вы, вероятно, увидите сверхскрученные, линейные и расслабленные (открытые) круги именно в таком порядке, поднимающемся по гелю. Но тогда все эти высшие формы повторяются для димеров, тримеров и т. д., образующихся в результате рекомбинации между молекулами плазмиды. Так, например, я думаю, что полоса размером 10 т.п.о. на неразрезанных дорожках представляет собой сверхскрученный димер. Я смутно припоминаю, что вы увидите больше подобных вещей, если ДНК будет приготовлена ​​из штамма recA E. coli .

update Вот кто-то, кто, я думаю, согласится.