В настоящее время я пытаюсь выяснить, содержат ли 2 бактерии плазмиды или нет. Я использовал набор для экстракции плазмид promega на бактериях. Я провел гель-электрофорез (0,8% геля) с продуктом экстракта, однако он не показал наличия какой-либо ДНК. Я также прогнал продукт через Nanodrop (2000), и вот какие концентрации я получил:
1: 6,5 нг/мкл и 260/280 = 1,56
2: 49,4 нг/мкл и 260/280: 1,96
Основываясь на опыте, я хочу сказать, что № 1 не содержит плазмид, однако № 2 может иметь небольшую концентрацию плазмид. Пожалуйста, выскажите свое мнение, какой вывод сделать. Кроме того, если есть другой тест, который я могу попытаться сделать, чтобы подтвердить наличие плазмиды или нет, пожалуйста, дайте мне знать.
Я не знаю, какой объем культуры вы использовали, но количество, которое у вас есть, больше похоже на плазмиду со средней/высокой копией. Не знаю, этого ли вы ожидаете от природной плазмиды.
В дополнение к другому ответу, это также может быть расщепленная геномная ДНК, космида (которая будет слишком высокой для вашего геля, чтобы ее увидеть) или, может быть, просто нуклеотиды (если вы каким-то образом испортили подготовку).
Другой способ выяснить, есть ли у вашего штамма плазмиды, зависит от того, что еще вы знаете об этих штаммах. Если вы не так много знаете: сделайте секвенирование 16S, это может быть известный штамм с известными плазмидами. Если вы уже знаете, что это недавно обнаруженный штамм: секвенируйте все это. Даже при относительно низком покрытии присутствие плазмид будет совершенно очевидным. Это немного дороже, чем подготовка плазмид + гель, но вы также получите много другой информации об организме.
Положительные показания Nanodrop, но отсутствие полосы на геле может быть связано с рядом различных проблем (не исчерпывающих):
Вы должны попытаться исключить эти возможности с помощью положительных контролей, чтобы выяснить истинную причину противоречивых результатов.
Я бы порекомендовал переключить вашу программу клонирования ПЦР. Часто даже после очистки ДНК и РНК в сочетании с большой осторожностью ПЦР может быть узким местом для гель-электрофореза, а также обеспечение качества (глубина, отсутствие тупых краев и т. д.) агарозного геля - 49 нг/мкл. достаточно для прогресса. Если все это по-прежнему не улучшает ваш случай, то это может быть проблема с культивированием бактериальных культур - после очистки плазмид от бактериальных клонов флаконы должны выглядеть очень мутными (8-16 часов был мой временной период), кроме того, старайтесь избегать воздействие света на агарозный гель, а также поддержание его в чистоте и погружение в холодный PBS перед введением забуференной ДНК (я использовал 10 микролитров, но это зависит от толщины вашего геля). Кроме того,
Если ничего не работает... тогда я могу только намекнуть на возможные человеческие ошибки. Последнее! Я надеюсь, что вы очистите нанодроп перед подсчетом, потому что белок в вашем продукте может быть результатом этого. удачи! Бактерии тоже нужна любовь!
В зависимости от того, как вы следовали протоколу, теоретически в вашем образце также может быть бактериальная геномная ДНК. Если вы будете строго следовать протоколу, этого не должно произойти, но если это так, вы сможете измерить геномную ДНК. Однако в агарозном геле он обычно застревает в верхней части, поскольку он слишком велик для миграции.
Это может быть вызвано, например, встряхиванием образца перед загрузкой колонки (см. руководство Promega PureYield).
Крис
пользователь137
А. Радек Мартинес