Возможные причины застревания ДНК в колодце

Этому есть одна простая причина: ваш агарозный гель, скорее всего, слишком плотный. В зависимости от типа агарозы я бы приготовил максимум 0,5-0,6% гель.

Synbio дает этот список для «стандартной» агарозы, который очень хорошо соответствует моему опыту. Если вы используете легкоплавкую агарозу, эта таблица выглядит несколько иначе, так как гелевая матрица не является плотной. Недостатком является то, что гель гораздо более подвержен повреждениям при обращении.

После того, как вы проверите свой гель, вам следует проверить праймеры, подготовку, качество самого XNA, затем надлежащие уровни электрофореза и другие механические неисправности. Я думаю, что неправильное сопротивление проводки электрофореза вызовет вашу проблему.

Во-первых, как вы упомянули, что, я думаю, является ключевым, вам нужно уточнить, какой именно образец ДНК вы наблюдаете в геле. Лучшее, что можно сделать, чтобы убедиться, что у вас есть только образцы ДНК, созданные с помощью ПЦР, — это обработать вашу смесь ДНК ферментом Dpn I, который разрезает метилированную ДНК, которая по существу является клеточной ДНК, поскольку они метилируются в клетках, и это не должно влиять на ДНК, сгенерированную методом ПЦР, поскольку она не будет метилирована. Дополнительные инструкции по использованию Dpn I см. на стр. 7 и 12 этого документа ( http://www.chem.agilent.com/library/usermanuals/Public/210518.pdf ). Впоследствии вы можете очистить и изолировать полученную методом ПЦР ДНК с помощью любого набора, такого как набор для экстракции из геля QIAquick (QAGEN), в основном с использованием этого протокола, но без использования гелей (http://sites.bio.indiana.edu/~chenlab/protocol_files/agarose_gel_extraction.pdf ). Вы можете использовать другие наборы, но этот всегда работал для меня! (Обратите внимание, что я не рекламирую здесь какие-либо наборы!!) Теперь, если у вас есть какие-либо ампликоны из вашей ПЦР, вы сможете добавить их в нанодропы (используя соотношение 260/230 в качестве ориентира) и получить разумное значение для вашего концентрация ампликона.

Теперь, если на этом этапе у вас все еще есть ваша ПЦР-ДНК, как показано нанодропом, и, возможно, тестовый дайджест все еще дает ожидаемые полосы, тогда проблема связана с текущим процессом и, скорее всего, с вашим гелем, что было первым, что я заподозрил. Если нет, то у вас нет никаких ампликонов, и вы просто пытаетесь запустить свою исходную ДНК.

Хотя я никогда раньше не работал с очень большими молекулами клеточной ДНК (я работаю с плазмидами), тем не менее я был обучен работе с очень большими молекулами ДНК (в агарозном геле) при очень низком напряжении, таком как 10-50 В, в течение ночи в холодной комнате, так как большие клеточная ДНК не очень хорошо работает в гелях, хотя это в основном относится к хромосомной ДНК, но 10 кб все еще довольно много. Раньше я запускал плазмидную ДНК размером 12 т.п.н. в гелях при более высоких напряжениях, но лучше использовать низкое напряжение, поскольку оно позволяет избежать разрывов и срезов ДНК!