Является ли EC50 активирующего белка для фермента хорошим индикатором аффинности связывания Kd?

Вы, безусловно, можете получить огромную разницу между EC ₅₀ и аффинити. Это особенно верно для клеточных анализов и мембранных белковых систем.

Причина этого в том, что соответствующие временные шкалы для достижения равновесия связывания (часы для нМ аффинности, дни для пикомолярной, фептомолярной аффинности в соответствии с расчетами обратной стороны конверта) могут отличаться и, вероятно, будут отличаться от соответствующих временных шкал активации, эндоцитоза, деградация и т. д. Кроме того, у вас могут быть эффекты авидности, которые не были бы очевидны в анализе разбавленной мембраны по сравнению с поверхностью клетки. Очень может быть, что доминирующие термины в массопереносе меняются в зависимости от геометрии и плотности антигена, и хотя я не совсем уверен в отношении везикул и эмульсий, это верно для моделей рака. Теоретический анализ нацеливания антител на опухолевые сфероиды: важность дозировки для проникновения и сродство для удержания.

Тематическое исследование номер I : взаимодействия hGH:hGHR были тщательно изучены, и был получен hGH с высокой аффинностью. Однако ни один из вариантов не показал улучшенной EC ₅₀ . Оказывается, на связывание в первую очередь влияли скорости диссоциации, которые были настолько медленными, что влияние на эти значения мало повлияло на кинетику системы. Сродство связывания гормона роста с его рецептором превосходит требования к клеточной активности

Тематическое исследование номер II: СЕА-антитела имеют созревшую аффинность, чтобы иметь активность pM по сравнению с аффинностью nM дикого типа. Однако антитело оказывало минимальное влияние на поглощение опухолью. Поскольку СЕА подвергается эндоцитозу порядка 30 минут, все антитела просто подвергались эндоцитозу, а не действовали как ингибитор. Направленная эволюция антираково-эмбрионального антигена scFv с 4-дневным периодом полураспада моновалентной диссоциации при 37°C .

(редактировать) Я понял, что этот ответ больше применим к IC ₅₀ s по сравнению с экспериментами EC ₅₀ , описанными выше. Тем не менее, многие моменты остаются. Km между субстратом и его ферментом является термодинамическим свойством, тогда как EC ₅₀ также имеет динамические факторы, которые могут влиять на его измерение.

Я бы также добавил, что простое изменение pH на 2 единицы может привести к изменению активности на 2 порядка.

(edit2) Еще один момент, который следует отметить в отношении ферментативных анализов, заключается в том, что, исходя из наблюдения за кинетикой Михаэлиса-Ментен, K _M реакции - это не K _D фермента, а, альтернативно, эффективная константа связывания.

Напомним, что:

При наличии нетривиального k _кат , сравнимого со скоростью диссоциации k _r , фермент будет иметь эффективную полумаксимальную концентрацию, значительно превышающую K _d . Есть несколько способов, как ваш анализ может привести к несоответствиям, которые вы видите. Во-первых, это ваша стратегия измерения EC ₅₀ . Если одно из них является ферментативным, а другое — связывающим, вы, естественно, получите очень разные результаты. В качестве альтернативы, фермент в детергентной системе может быть каталитически более активным, чем везикулярная система, что приводит к более высокому эффективному K _M . Опять же, рН вещь.

Наконец, всегда наступает неловкий момент, когда вы понимаете, что могли случайно измерить кривую титрования, а не кривую связывания.

В дальнейшем я попытаюсь ответить на ваш вопрос, используя конкретный пример (конкурентной) обратимой активации, и я надеюсь показать, каким может быть вводящий в заблуждение параметр EC ₅₀ . (Вывод закона скорости представляет интерес, отсюда и многословный ответ).

Он , конечно, может дать информацию, но ИМО его нужно использовать с особой осторожностью.

Я ограничиваю свои комментарии случаем, когда A является обратимым активатором и где [A] >> e _o и [S] >> e _o . (Все константы определены ниже).

Короче говоря, я не рассматриваю необратимую активацию и не рассматриваю случай, когда А считается активатором с сильной связью (так что [А] ≈ e _o ). Другими словами, я делаю стационарное приближение ( Бриггс и Холдейн , 1925) .

Рассмотрим следующий простой механизм активации односубстратного фермента:

Механизм конкурентной обратимой активации

Субстрат (S) не может связываться со свободным ферментом (Е), если не присутствует активатор (А). То есть только активатор может связываться (обратимо) с Е, а субстрат связывается (обратимо) с комплексом ЕА. Реакция происходит внутри комплекса EAS (с образованием EAP). Диссоциация продукта (P) от EAP дает EA.

Закон (стационарного) начального уровня для описанного выше механизма следующий:

Как указано, все константы определены ниже и следуют обычным определениям в кинетике ферментов. Я упомяну здесь только об одном: _KA — константа диссоциации активатора, имеет единицы концентрации.

Я вывел эти уравнения, используя компьютеризированную версию метода Кинга и Альтмана ( King & Altman , 1956), но сделать это несложно . Чистая лень помешала вывести «первые принципы». Вывод закона скорости подробно рассматривается в большинстве книг по кинетике ферментов, и хорошие отчеты можно найти в Segel (1975) и Cornish-Bowden (2004).

Теперь можно сделать следующие выводы

• Без А нет активности (как и следовало ожидать).
• Когда [A] >> K _A , закон скоростей становится идентичным уравнению Михаэлиса-Ментен (как и следовало ожидать).
• Уравнение похоже на случай конкурентного торможения , но (обратите внимание на тонкое изменение) с (1 +  K _A  / [A]) заменой (1 + [I] /  K _i )
• Этот механизм можно рассматривать как пример конкурентной активации

Определение

• ν _i ^exc     = начальная скорость, когда A находится в значительном превышении [ т.е. установка [A] равной ∞ в уравнении (1)].
• EC ₅₀     = концентрация А, при которой ν _i равно ν _i ^exc / 2 (полумаксимальная активация)

позволяет вывести следующие два уравнения:

Установка левой части приведенного выше уравнения равной 2 и решение для [A] дает следующее важнейшее уравнение

Теперь можно сделать следующие выводы

• Когда [S] = K ^S _m

  

  Другими словами, когда субстрат присутствует в концентрации, равной константе Михаэлиса, значение EC ₅₀ составляет половину значения K _A !.

• Когда [S] >> K ^S _m

  

  Когда [S] = 10 x K ^S _m , например, EC ₅₀ составляет одну десятую значения K _A , а когда [S] = 100 x K ^S _m цифра составляет одну сотую.

• Когда [S] << K ^S _m

  

Таким образом, для конкурентного активатора только когда [S] << K ^S _m EC ₅₀ дает приемлемую оценку K _A .

Концентрация субстрата в «нормальном» ферментативном анализе, вероятно, будет равна или больше константы Михаэлиса (чтобы «видеть» активность), и, таким образом, EC ₅₀ будет заниженной оценкой K _A .

Если субстрат присутствует в «насыщающей» концентрации (скажем, 10 x KS ^m ₎ , то у человека серьезные проблемы.

Однако это не единственное соображение. Помимо зависимости от концентрации субстрата, способ, которым EC ₅₀ зависит от [субстрата] , зависит от механизма .

Как кратко обсуждается ниже, случай конкурентной активации аналогичен случаю конкурентного ингибирования. Однако для неконкурентного ингибирования _Ki ( константа ингибирования) равна только IC ₅₀ (концентрация ингибитора, дающая полумаксимальное ингибирование) при высокой концентрации субстрата ! (см. Наки , 1982). По аналогии можно сделать вывод, что то же самое относится и к неконкурентной активации.

Очень трудно увидеть, как EC ₅₀ может иметь какое-либо практическое применение, за исключением, возможно, случаев, когда известен механизм активации. По крайней мере, выводы, сделанные на основе данных EC ₅₀ , не следует считать окончательными.

Кроме того, я рассмотрел единственный случай односубстратной реакции. Реакции с двумя субстратами могут быть еще более сложными.

---

Иллюстративный пример (конкурентная активация)

Давайте возьмем пример и проверим некоторые выводы:

• k ^f _кат    = 1000 с ^-1
• е _о    = 1
• К ^S _м    = 10 мкМ
• К _А =      50 мкМ

Можно рассчитать, что:

• Когда [S] равно 10 мкМ (т. е. когда [S] равно K ^S _m ) и когда [A] «насыщается» (ради аргумента, установленного равным ∞), скорость составляет 500 мкМ с ^-1 . [из уравнения (1)].

  Из уравнения (2) концентрация А, необходимая для достижения половины этого значения (половина максимальной активации), составляет 25 мкМ (EC ₅₀ равна 25 мкМ ) .

  Это значение можно вычислить непосредственно из уравнения (3)

• Когда [S] равняется 100 мкМ (т.е. [ ^S ] равняется 10 x KS _м ) и когда [A] «насыщается», скорость теперь составляет 909  мкМ с ^-1 [из уравнения (1) ].

  Из уравнения (2) концентрация А, необходимая для достижения половины этого значения, теперь составляет всего ~4,5 мкМ .

  Это значение можно рассчитать непосредственно из уравнения (3) [EC ₅₀ равно (50 / 11) мкМ ]

• Когда [S] равно 1 мкМ (т.е. [S] равно одной десятой константы Михаэлиса) и когда [A] «насыщается», скорость теперь составляет только ~91 мкМ с ^-1 [из уравнения (1)] .

  Из уравнения (2) концентрация A, необходимая для достижения половины этого значения, составляет ~ 45,5 мкМ (теперь почти равна K _A ) .

  Это значение можно рассчитать непосредственно из уравнения (3) [EC ₅₀ равно (500 / 11) мкМ ]

---

Обратимое ингибирование и IC ₅₀ . Краткий комментарий

Ни в одном из вышеперечисленных нет ничего нового. В области ингибирования ферментов хорошо известны недостатки IC ₅₀ (концентрация ингибитора, обеспечивающая 50% ингибирование) и связь с константой ингибирования [см., например, Chou (1974), Segel (1975), Naqui (1982) & Tsou (1987)], но (мне кажется) часто игнорируются.

В статье Наки дается очень краткий анализ ситуации, а pdf -файл находится в свободном доступе для всех.

Обратимые ингибиторы можно разделить на четыре класса в зависимости от характера ингибирования: конкурентные, неконкурентные, неконкурентные и «смешанные» (см. Naqui , 1982 и ссылки в этой публикации).

Во всех случаях, кроме неконкурентного ингибирования, K _i ≠ IC ₅₀ , а IC ₅₀ зависит от субстрата.

(Неконкурентное ингибирование — это «случайное» ингибирование, когда так получилось, что каталитическая константа и константа специфичности ( k ^f _cat / K ^S _m ) изменяются в одинаковой степени или, другими словами, наклон и фрагмент графика Лайнуивера-Берка (так уж получилось) изменены в той же степени)

Для неконкурентного ингибитора (как указано) IC ₅₀ равна Ki только при высокой концентрации субстрата (см. Naqui _, 1982).

_{Как и} в случае конкурентной активации, IC ₅₀ равна Ki для конкурентного ингибитора только при низких концентрациях субстрата (см. Naqui , 1982).

«Смешанное» ингибирование является еще более сложным, и константа ингибирования может быть больше или меньше IC ₅₀ в зависимости от экспериментальных условий (см. Naqui , 1982).

Отличный вопрос, кстати.

---

Приложение

Поскольку я вывел полную форму закона ставки (в отличие от закона начальной ставки), возможно, стоит опубликовать ее. Закон начальной скорости получается из этого уравнения, приравнивая [P] к нулю.

Кинетические константы, определенные в терминах констант скорости

Константы скорости пронумерованы (в виде нижних индексов) от видов к видам с нумерацией, как на диаграмме.

Таким образом, константа скорости k _1,2 равна константе скорости от E (вид 1) до EA (вид 2).

• Каталитические константы

  

  

• Константы Михаэлиса

  

  

• Константы специфичности

  

  

• Активация (константа диссоциации)

  

---

Кинетическая константа Определение

• ν скорость

• ν _i    начальная скорость

• K ^S _m    постоянная Михаэлиса для S

• K ^P _m    постоянная Михаэлиса для P

• k ^f _cat    каталитическая постоянная (в прямом направлении)

• k ^r _cat    каталитическая постоянная (в обратном направлении)

• V _max    максимальная скорость, равная k ^f _cat e _o

• e _o    общая концентрация фермента

  

• K _A      константа диссоциации для (активатора), равная k _2,1 / k _1,2 , с единицами концентрации (скажем, молярностью) [константы скорости пронумерованы от вида к виду , нумерация как на диаграмме].

• ν _i ^{превосходит}    начальную скорость при избытке A ([A] = ∞).

• EC ₅₀    концентрация А, которая дает ν _i , равную ν _i exc / 2 (полумаксимальная активация)

• [A] Начальная концентрация активатора.

• [S] Начальная концентрация субстрата.

---

Закон скорости и диаграммы были получены с помощью Mathematica . Для Matematica в SE см. здесь

---

использованная литература

• Бриггс, GE и Холдейн, JBS (1925). Замечание о кинетике действия ферментов. Биохим. Дж . 19 , 338 - 339. [ pdf ]

• Chou, TC (1974) Взаимосвязь между константами ингибирования и фракционным ингибированием в катализируемых ферментами реакциях с различным количеством реагентов, различными механизмами реакции и различными типами и механизмами ингибирования. Мол. Pharmacol ., 10 , 235-247 [ опубликовано ]

• Корниш-Боуден, А. (2004). Основы кинетики ферментов. 3-е изд. Портленд Пресс Лтд, Лондон.

• Кинг, Э.Л. и Альтман, К. (1956). Схематический метод вывода законов скорости реакций, катализируемых ферментами. Дж. Физ. хим . 60 , 1375 - 1378. [ сайт АКГ ]

• Наки, А. (1982). Что означает I50? (1983) Биохим. Дж . 215 , 429-430 [ pdf ]

• Сегель, ИХ (1975). Кинетика ферментов. Поведение и анализ ферментных систем быстрого равновесия и устойчивого состояния. John Wiley & Sons, Inc., Нью-Йорк.

• Tsou, CL (1987) Скрининг лекарственных препаратов, нацеленных на ферменты. Биоэссеи , 6 , 237-238. [ опубликовано ]