Я пытаюсь найти микроРНК, которые связываются с 3'UTR определенного гена. Как лучше всего это сделать (то есть с помощью хорошего скорингового анализа, который чаще всего используется исследователями в этой области)? Я также хотел бы знать другие возможные методы, если есть несколько способов сделать это.
Есть несколько инструментов для предсказания привязки:
1 Контекст означает положение целевого сайта в 3'UTR и окружающий нуклеотидный состав (что также считается косвенным показателем вторичной структуры).
miRanda и TargetScan также имеют классы, называемые консервативными и неконсервативными мишенями. miRanda сообщает об оценках miRSVR, а TargetScan сообщает о контекстных оценках, но эти показатели основаны на нескольких экспериментальных результатах и могутне всегда иметь смысл. miRSVR основан на изменении экспрессии мишени при сверхэкспрессии/нокдауне микроРНК. Он также использует метрики для контекста целевого сайта. Контекстная оценка TargetScan включает в себя множество показателей, в том числе обилие и сохранение целей, а также обычную контекстную оценку. Некоторые из этих показателей могут быть более полезными, чем другие. Но оценки, основанные только на экспериментах miRNA OE/KD, могут вводить в заблуждение, особенно если экспрессия мишени количественно определяется только на уровне РНК. Численность мишени также варьируется между различными типами клеток. Дополнительные сведения об этих показателях см. в документах, соответствующих этим инструментам.
Существуют некоторые экспериментальные процедуры для определения мишени, которые в основном включают перекрестное связывание белок-РНК с последующей иммунопреципитацией Ago и последующей количественной оценкой с помощью секвенирования РНК. См. HITS-CLIP и PAR-CLIP . Эти методы на самом деле не находят цели. Все, что они делают, — это коррелируют уровни миРНК и их предполагаемых мишеней, прикрепленных к Ago (вы не будете точно знать, действительно ли образовался тройной комплекс мРНК-миРНК-Ago или нет).
CLASH — это более поздний метод, который пытается решить эту проблему путем лигирования мРНК с микроРНК. Таким образом, вы можете зафиксировать взаимодействие микроРНК-мРНК. Однако я немного скептически отношусь к CLASH; Я сам работал над этим принципом некоторое время назад и столкнулся с этой проблемой. CLASH включает в себя следующие этапы:
Мои сомнения заключались в том, как можно лигировать miRNA и мРНК, когда след Ago больше, чем у miRNA (около 50-60 нуклеотидов в HITS-CLIP и PAR-CLIP). Если РНК защищена нуклеазой, то как она может быть доступна для лигазы? Когда я думал об этом, я подумал, что необходима частичная деградация белка (после этапа РНКазы и перед этапом лигазы), чтобы дать некоторое пространство для действия лигазы. В конце концов я не работал над этим дальше. Три года спустя статья CLASH была опубликована, и я был счастлив, что кто-то заставил ее работать. Но проблема с лигазой не была решена (похоже, это сработало, но я не знаю, как!!).
Чтобы проверить предсказания, вы можете использовать репортерный анализ (такой как GFP или люцифераза) с клонированием 3'UTR ниже репортера. У них тоже могут быть артефакты. Следует избегать чрезмерной экспрессии микроРНК, а также следует проводить посевные мутации, чтобы установить способность к нацеливанию.
Другой метод определения мРНК-мишени состоит в том, чтобы замаскировать ее предсказанный сайт связывания микроРНК и увидеть влияние на экспрессию. Это было сделано у рыбок данио с использованием морфолино, комплементарных целевым сайтам, но не на других моделях, насколько мне известно. Это кажется мне элегантным анализом — никакой чрезмерной экспрессии, и вы можете точно определить целевой сайт.
Я бы тщательно проверил литературу по интересующим вас UTR, многое из этого уже было сделано для многих областей генома с момента запуска nextgen seq.
Вы захотите сначала использовать алгоритмы вычислительного прогнозирования, которые помогут вам получить хороший список кандидатов микроРНК.
Взаимодействие между микроРНК и ее мРНК-мишенью обычно изучается путем совместной трансфекции репортерного экспрессионного вектора, содержащего 3'-UTR область мРНК, и молекулы-ингибитора или предшественника микроРНК.
Но это не измеряет прямое и физическое взаимодействие между микроРНК и конкретной мРНК. Для более точного измерения связывания вам необходимо провести анализ изменения электромобильности.
Вот коммерческий инструмент, который будет хорошо работать, если вы просто пытаетесь его идентифицировать.
http://www.activemotif.com/catalog/905/lightswitch-synthetic-mirna-target-reporter-collection
Я не думаю, что есть какие-то другие очень эффективные/простые методы.
Я думаю, вы могли бы сделать что-то вроде гибридизации, запустить гибрид на геле, вытащить группу и секвенировать ее.
рхилл45
WYSIWYG
экагл
WYSIWYG