Если я гипотетически сделаю неактивную версию Cas9 или ZFN (которая будет связываться с ДНК, но не применяет реакцию расщепления). Что произойдет после того, как белок свяжется с ДНК? Не застрянет ли он там навсегда и нарушит ли процесс транскрипции/перевода? Или через какое-то время саморазвяжется?
Все реакции связывания обратимы. Связывание и развязывание (ассоциация и диссоциация) обычно находятся в равновесии. Какая часть белка связана с ДНК и сколько времени отдельная молекула находится в связанном состоянии, зависит от кинетических параметров. В случае некаталитического Cas белок может ингибировать транскрипцию, если он связан с промотором. Фактически такие неактивные варианты были разработаны и использованы для направленного ингибирования транскрипции ( Himeda et al., 2015 ).
Если CRISPR-Cas блокирует сайт связывания активатора транскрипции, то степень ингибирования будет зависеть от конкуренции между активатором и CRISPR -Cas -ингибитором за сайты связывания. Эта конкуренция будет зависеть от кинетических параметров, а также от концентрации конкурирующих видов.
Точно так же вы можете сконструировать белки/РНК, которые могут связываться с мРНК (в RBS у прокариот или с последовательностями Козака у эукариот) и ингибировать трансляцию.
Еще один интересный факт: система CRISPR-Cas была спроектирована так, чтобы работать как активатор транскрипции ( Didovyk et al., 2016 ).
Всегда в замешательстве