E. coli не растет в жидкой среде

Мы регулярно проводим бактериальную трансформацию и пересев с чашек на жидкие среды для выделения ДНК. Обычно это происходит очень хорошо и просто, но иногда колонии, которые хорошо росли на чашке, не будут расти в жидкой культуре (с теми же антибиотиками, которые были в чашке). Это произошло сейчас с тремя людьми на нескольких плазмидах.

Например, я пытался лигировать ген устойчивости к ампициллину (с его промотором) внутри плазмиды pENTR4 (уже с устойчивостью к канамицину). Моя чашка и LB содержали два антибиотика, но колонии становились слегка мутными только через 16 часов.

Загрязнение фагом очень маловероятно, и этот эффект не может быть связан с токсичностью вставленного фрагмента, поскольку и вставка, и вектор без проблем выращивались в одних и тех же бактериях несколько раз.

Помощь?

EDIT1 - Мы используем карбенициллин вместо ампициллина в планшете, но не в жидких средах.

РЕДАКТИРОВАТЬ 2. После того, как мне удалось вырастить несколько колоний в жидкости, мне удалось получить небольшое количество плазмиды (профиль был хорошим, концентрация = 70 нг/мкл). Странно то, что когда я ретрансформировал эту ДНК в бактерии Stbl3, у меня не было абсолютно никаких проблем. Как вы думаете, могут ли быть виноваты запасы бактерий?

Вы недавно меняли свою партию антибиотиков или сред?
Самое простое объяснение: что-то в пробирках для культивирования или в бутылях для приготовления сред подавляет рост (остатки детергента?). Но многие люди видели то, что вы описываете, если чашки с колониями хранились слишком долго при температуре 4°C. Один из способов проверки (помимо сравнения среды +/- лекарства) состоит в том, чтобы «залатать» колонии на новой чашке с сеткой. - вы можете делать это регулярно, так делают многие люди. Таким образом, либо после обнаружения КОЕ-кандидатов на заделку в мастер-сетку, либо, когда вы инокулируете пробирки для минипрепаратов, также заделывайте КОЕ на новую чашку. Если пластина с исправленной сеткой растет, а культура не растет, вуаля.
В очень редких случаях латание показывает здоровые крошечные лужайки с проколотыми отверстиями от фагового заражения. Кроме того, если это фаговое заражение от литического фага, по моему опыту, бульон будет очищаться и накапливать небольшой волокнистый сгусток лизированных клеточных остатков, который плавает. Что, если бы существовал нелитический фаг, такой как M13? Похоже, вы внимательно рассматриваете «очевидные» причины. Определенно ЕСТЬ токсичные вставки, которые практически невозможно размножить в обычной E. coli, но тогда вы найдете только трансформанты без вставок (как правило), но, к счастью, это довольно редкое явление.
Антибиотики — это запасы, хранящиеся при температуре -20°C, и их одновременно использовал мой коллега, у которого была такая же проблема с некоторыми из его векторов (2/8). Поскольку мы успешно использовали один и тот же тип ламп, я сомневаюсь, что это могло быть причиной.
Вы пробовали трансформацию положительного контроля? Некоторого тестового вектора, например типа pEGFP
также ваш инкубатор может не работать, иногда люди без причины переключают температуру или выключают шейкер (возможно, в вашей розетке есть таймер, который срабатывает на ночь :)
Это преобразование было сделано с моим коллегой; мы сделали это вместе. В его плазмидах (материал, который он получил как есть из другой лаборатории и трансформировал непосредственно в бактерии) две из восьми представляли ту же проблему, что и моя. Остальные выросли отлично. Это было сделано на коммерческих бактериях DH5a, которые мы только что купили. Температура и вращение были в порядке.
насколько велики/многочисленны колонии на чашке?
Колонии были от малых до средних размеров. Это не имело никакого значения в целом.
Какой штамм E.coli вы используете?
А по поводу вашей вставки, у вас тоже есть терминатор? Потому что в своем посте вы только что упомянули промоутера и AmpR.
Я не уверен насчет терминатора, так как он не помечен...

Ответы (1)

Я думаю, что есть более чем одна возможность для этого.

  1. Чашки с колониями слишком долго хранятся в 4C (как предложил @mdperry). Это приводит к тому, что колонии со временем теряют плазмиду, поскольку антибиотик в чашке со временем разлагается. На эту тему есть исследование, и я поделился ссылкой. ( http://homepages.bw.edu/~mbumbuli/biotech/colin/index.html ).
  2. Вставка токсична для клеток, а промотор недостаточно силен. Существует дырявое выражение, вызывающее гибель клеток.
  3. Проверьте компетентные клетки и условия их хранения, так как это сильно повлияет на эффективность трансформации. Сделайте фиктивную трансформацию с простой плазмидой без вставки и распределите их на планшете с антибиотиком.
E. coli не растет в жидкой среде
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v