Я сейчас работаю над набором разнообразия, это разнообразие в межвидовом (в пределах одного рода). Я использую маркеры SSR, праймеры были разработаны для одного вида и очень хорошо работают в пределах вида (много разнообразия и различий между аллелями 1, по крайней мере).
Пробуя их на других видах, я наблюдаю нормальное отсутствие амплификации, которое может быть связано с мутацией в последовательности ДНК праймера. Но для некоторых генотипов я наблюдал новый аллель только между двумя старыми (например, новый 185,5, а старые 185 и 186.
Часто ли наблюдаются подобные наблюдения при использовании праймеров, разработанных для других видов?
Я понимаю, как может возникнуть разница в 1 пб CACACA==> CACCACA, но каковы могут быть биологические объяснения разницы между аллелями в 0,5 пб?
По моему опыту работы с аналогичным подходом к Campylobacter jejuni , измерения пар оснований с помощью этих методов неточны и требуют тщательной калибровки. Я не удивлен, увидев разницу в 0,5 пары оснований, это можно увидеть в прогонах и даже, в худшем случае, между четными и нечетными лунками в одном и том же планшете (!).
Я бы использовал секвенирование по Сэнгеру, чтобы определить последовательность, которую вы получаете в одном из ваших изолятов, а затем использовал бы это в качестве калибровочного контроля, включенного в каждый анализ.
Унтитпои
Джек Эйдли
Джек Эйдли