Я пытаюсь воспроизвести метод клеточной биологии из лабораторного исследования 1958 года. Протокол предназначен для выделения белка внеклеточного матрикса, и ключевым этапом является центрифугирование, проводимое в течение 2 часов при 2300 об/мин. По-видимому, не было обычной практикой указывать марку, модель и размер ротора центрифуг, поэтому я немного запутался в том, какие настройки использовать на моей собственной центрифуге, чтобы получить такое же центробежное ускорение.
Есть ли хорошие отправные точки для оценки правильных настроек? например, кто был основными поставщиками центрифуг в то время или какие модели считались «стандартными» для лаборатории клеточной биологии?
Я не уверен, что они использовали в 1958 году (возможно, Sorvall). Однако вы можете просмотреть недавние статьи по выделению белка ECM (если это было вашей целью).
Взгляните на эту статью.
Из материалов и методов:
Выделение белка ECM .
Фибробласты или клетки А431 удаляли с поверхности культурального планшета 2 мМ ЭДТА в PBS в течение 3–5 мин при 37⁰C. Отслоившиеся клетки отбрасывали, а оставшиеся белки ВКМ, прикрепленные к поверхности культуральных планшетов, промывали тем же раствором. Удаление клеток контролировали под микроскопом. После полного удаления клеток белки матрикса покрывали 5% уксусной кислотой и инкубировали при 4⁰C в течение ночи. Затем уксусную кислоту удаляли и заменяли буфером, содержащим 125 мМ Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 10% глицерина, 1% ДДТ, 0,05 мМ PMSF, смесь ингибиторов протеаз (Roche, Германия), и инкубировали при 37⁰C. на 1 ч. Белки удаляли скребком. Процедуру повторяли трижды. Все белковые экстракты, включая уксусную кислоту, объединяли и белки ЕСМ осаждали пятью объемами ацетона.
Кроме того, мы получили растворимую в Тритоне Х-100 фракцию белков ВКМ. Клетки удаляли, как описано выше; чашки заполняли 1% Triton X-100 и инкубировали при 37⁰C в течение 30 мин. Экстракцию повторяли трижды. Следующая процедура экстракции ЕСМ была такой же, как описано выше. Образцы, полученные из обеих фракций, растворяли в буфере для одномерного (Лэммли) или двумерного (регидратационный буфер, содержащий 8 М мочевины, 2% CHAPS, 20 мМ ДДТ, 0,1% Тритон Х-100) электрофореза. Белки, оставшиеся после экстракции Triton X-100, растворяли в буфере для образцов Лэммли.
пользователь137
WYSIWYG
Честейн
Честейн