Как убедить суспензионные клетки крепче слипаться?

Я разрабатываю клеточный анализ в 96-луночных планшетах, для которого требуются прикрепленные клетки, так как их нужно промывать по крайней мере дважды в течение протокола. Я использую собственные штаммы клеток HT1080 (некоторые из них сверхэкспрессируют определенный интересующий белок), которые, к сожалению, были отобраны для выращивания в суспензии в химически определенных средах (50/50 CD-CHO / CD-293 ). Я могу убедить их прилипнуть, культивируя в среде DMEM с 10% FBS и выращивая их в колбах CELLBind , но они все равно имеют тенденцию отрываться, если существует очень большая сила сдвига, например, во время этапов промывки или когда они находятся в PBS. во время этапов промывки и инкубации (может быть, всего 2 часа на данный момент, я все еще оптимизирую это).

К сожалению, параметры моих экспериментов не позволяют мне держать клетки в средах, содержащих сыворотку, во время анализа, так как это будет мешать поглощению моего препарата. Как я уже сказал, в PBS они начинают отделяться, и я предполагаю, что то же самое и в HBSS, который я все равно не хочу использовать из-за его низкой буферной способности в инкубаторах с CO 2 .

Может ли DMEM в одиночку (без FBS) дать немного больше стимула оставаться привязанным во время анализа? Каков будет эффект увеличения количества FBS, скажем, до 15 или 20% во время культивирования - будет ли это способствовать более сильной привязанности? Я немного сомневаюсь, стоит ли покрывать лунки поли- D -лизином, так как показания у меня флуоресцентные, и я опасаюсь, что это существенно увеличит фон. У меня действительно нет достаточно времени, чтобы повторно выбрать клетки для прилипающего роста (хотя, если бы я знал об этих проблемах от моего предшественника 3 или 4 месяца назад, я бы начал сразу же...), так есть ли какие-либо другие трюки, которые я могу попробовать тем временем? Есть ли какие-либо медиа-добавки, которые я мог бы использовать для стимулирования экспрессии адгезина или что-то в этом роде? Любые советы или советы вообще будут оценены.

Я бы предложил разделить ваше редактирование на новый вопрос, похоже, это был бы хороший вопрос сам по себе.
@MadScientist - это правда, я об этом не подумал. Подступила!
Я уже точно этого не помню, но разве не были доступны планшеты для культивирования клеток с мембранным дном, которое позволяло удалять жидкости центрифугированием, в то время как клетки оставались на мембране?

Ответы (2)

Меня больше всего беспокоит то, почему вы используете отобранные клетки в суспензионной культуре для анализа на основе адгезивных клеток? Можно ли получить клон приверженца HT1080? В зависимости от того, что вы анализируете с интересующим вас белком, биология клеток может измениться при переходе от систем суспензионных/адгезивных культур.

Вот мой опыт использования клеток PC12 в культуре, которые представляют собой слабо адгезивные клетки, предпочитающие расти группами, а не монослоями. Я обнаружил, что эти клетки предпочитают специфическую тканевую пластику; (без упоминания названий), эти клетки будут прилипать к некоторым пластинам, покрытым поли-D-лизином, и не будут прилипать к другим. Я обычно провожу иммунофлуоресцентную микроскопию этих клеток и выращиваю их на покровных стеклах, которые я предварительно покрыл коллагеном I типа крысиного хвоста. Это покрытие обеспечивает незначительный фон в зеленом диапазоне и только при съемке близко к стеклу. С ярким флуорофором (например, AlexaFluor или цианиновые красители для фиксированных клеток; усиленный GFP для живых клеток) этот фон не представляет проблемы для количественной микроскопии.

Наконец, для анализа секреции мы используем DMEM с высоким содержанием глюкозы, дополненную 1% диализированного FBS. Если мне не изменяет память, это сохраняет все компоненты сыворотки менее ~ 15 кДа, включая различные факторы роста. Я наблюдал, как эти клетки продолжают жить до одного дня (а может быть, и дольше?) в обогащенной среде, в то время как они умирают через несколько часов без нее. Это также может помочь с неспецифическим связыванием, о котором вы можете беспокоиться при добавлении лекарств.

Спасибо за обмен вашего опыта. Основная причина, по которой я использую клетки, заключается в том, что их используют все остальные в компании, и они были адаптированы к выращиванию в суспензии для масштабного производства… материалов (фармацевтические исследования и разработки). Некоторые из линий представляют собой различные клоны со сверхэкспрессией определенного рецептора, хотя после разговора с моим боссом мы могли бы обойти это в нашем экспериментальном проекте. Мой бюджет не такой уж большой, поэтому я пытаюсь работать с тем, что у меня есть, хотя, если то, что у нас есть, не сработает, нам нужно будет найти что-то еще :)
Просто для протокола: я ненавижу клетки PC12. Вы совершенно правы насчет того, что они растут в одних сосудах, а не в других, и только в очень специфических средах и при очень специфических плотностях. Они снимут тарелку только назло вам, и если они не умирают каждый третий проход, они заражаются. Удачи с ними, я вам не завидую!
Спасибо MattDMo, им потребовалось много времени, чтобы устранить неполадки! Самая большая проблема сейчас — получить их с нужной плотностью для визуализации отдельных клеток, а не с каким-то неуклюжим неразрешимым скоплением. ;)
попробуйте желатиновое или коллагеновое покрытие на культуральных чашках.
@WYSIWYG - В настоящее время я покрываю покровные стекла коллагеном. Природа клеток PC12 заключается в том, что они предпочитают расти в непосредственной близости друг от друга и по мере своего роста спонтанно образуют клеточные скопления.

Вы пробовали использовать микропланшеты DropArray? Это новая технология, в которой вам не нужно центрифугировать клетки, чтобы отмыть их... мой старый коллега работает в компании, и они очень здорово демонстрируют продукты/инструменты для вас. Это http://www.curiox.com/ .

Я думаю, что большинство людей, которые используют систему, используют суспензионные клетки из-за проблем, которые вы перечислили выше, так что, возможно, стоит взглянуть!

Удачи!

Интересно. Я должен проверить их немного больше. Я больше не разрабатываю анализ (я разместил вопрос год назад), но в итоге я переключил платформы на проточную цитометрию и просто использовал планшеты с круглым и v-образным дном.
Как убедить суспензионные клетки крепче слипаться?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v