Как очистить загрязненную фенолом РНК без потери образца?

Недавно я впервые выделил РНК из листьев развивающихся растений в рамках очень длительного и интенсивного эксперимента. Образцы были чрезвычайно ценны из-за большого количества усилий, которые были затрачены на их получение (сбор тысяч крошечных листьев, по одному с каждого растения, для получения необходимой массы).

Я экстрагировал РНК тризолом и хлороформом. Nanodrop показал отличный выход, как и следовало ожидать от активно растущей молодой ткани, но у некоторых образцов было очень низкое соотношение 260/230. Я знаю, что это указывает на загрязнение фенолом или солью, но что я могу сделать, чтобы очистить образцы, не потеряв при этом ценную РНК? И как избежать заражения в будущем?

Ответы (2)

Вы можете очистить фенол, промыв хлороформом, а затем выполнив осаждение изопропанолом с последующей промывкой 75% EtOH (дайте мне знать, если вам нужен точный протокол).

Чтобы избежать контаминации (и потери пробы), вы должны быть аккуратны при пипетировании (что станет лучше с практикой). Вы всегда можете использовать те пробирки с фазовой синхронизацией, которые в основном запирают твердый гель между водной и органической фазами, поэтому его намного легче пипетировать.

Какая часть пипетирования является важной частью? Удаление прозрачной верхней фазы после центрифугирования? Если да, то оставляют ли большинство людей немного верхней фазы, чтобы избежать загрязнения? Я пытался получить все до последней капли!
@RichardSmith Да, пипетирование органической / водной фазы имеет решающее значение. Это зависит от (1) того, насколько хорошо вы умеете пипетировать и (2) насколько «ценны» ваши образцы. Конечно, если вы более тщательно относитесь к получению как можно большего количества образцов, существует компромисс между выходом и чистотой. Если я могу выделить немного образца, я обычно оставляю совсем немного, чтобы не касаться мусора в интерфазе между двумя слоями.
Должно быть, я не так хорош в пипетировании, как я думал! Большое спасибо за ваш ответ. Я позабочусь о том, чтобы научиться лучше пипетировать, а тем временем оставлю безопасное количество водной фазы.
@RichardSmith Возможно, это была не совсем ваша вина. Стандартной процедурой является очистка РНК изопропанолом и этанолом, чего, похоже, вы не сделали. Как только вы это сделаете, вы должны получить сверхчистую РНК, даже если при пипетировании была неровность.
Я очистил изопропанолом и этанолом, а затем нанодропом. Я беру на себя полную ответственность!
@ jp89, Насколько я понимаю, IPA и этанол эффективно очищают только от солей. Экстракция фенол-холороформом намного лучше справляется с удалением белков. Возможно, вы могли бы взять часть интерфазы и снова очистить. Фенол повлияет на ваши колонки и повлияет на ваши выходы.
Также, чтобы избавиться от всех следов фенола, попробуйте экстрагировать эфиром.

Преципитация этанолом должна работать. Но я добился больших успехов, используя колонки для очистки РНК Qiagen, которые, на мой взгляд, проще. Вот URL-адрес для просмотра столбцов очистки РНК, которые предлагает Qiagen: http://www.qiagen.com/products/rnacleanupconcentration/default.aspx

Также в будущем следует рассмотреть возможность использования трубок PhaseLock:

http://www.5prime.com/products/nucleic-acid-purification/organic-nucleic-acid-extraction/phase-lock-gel-.aspx

Это спасло меня от вашей точной проблемы много раз.

Большое спасибо за ответ и ссылки. Трубки PhaseLock буду иметь в виду - беру с PhaseLock не нужен комплект для чистки?
О, и добро пожаловать в biology.SE :)
Спасибо. Только что зашел на Home Brewing.SE и увидел, что есть и биология. Кажется, это хорошая идея. ;-)
Как очистить загрязненную фенолом РНК без потери образца?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v