Я пытаюсь создать библиотеку NGS на обогащенной ДНК (длина ДНК = 93 п.н.). Я использую ПЦР-амплификацию с двумя выступающими праймерами, оба содержат последовательности адаптеров Illumina (универсальный адаптер и адаптер TruSeq со штрих-кодом). Моя окончательная библиотека должна быть (~ 182 п.н.):
Универсальный адаптер (-), обогащенная ДНК (+), адаптер TruSeq (=)
------------------++++++++++++++++++++++++========== ========
После ПЦР-амплификации и контроля качества на геле я вижу фрагменты большего размера. Анализ, проведенный компанией Bioanalyzer, показывает, что у меня может происходить некоторая полимеризация адаптера TruSeq в библиотеке. Скорее всего, это связано с плохим дизайном праймера, который содержит две последовательности распознавания (21 нуклеотид), одну на 3'-конце и одну на 5'-конце адаптера TruSeq.
Мой вопрос:
Как повлияет на анализ NGS, если для секвенирования будет отправлена библиотека, содержащая смесь одиночных и двойных адаптеров TruSeq?
Одинокий:
Универсальный адаптер (-), обогащенная ДНК (+), адаптер TruSeq (=)
------------------++++++++++++++++++++++++========== ========
Двойной:
Универсальный адаптер (-), обогащенная ДНК (+), адаптер TruSeq 1 (=), адаптер TruSeq 2 (=)
------------------++++++++++++++++++++++++========== ========\===================
Будет ли потеряна информация о секвенировании из «двойной библиотеки» или эти фрагменты будут прочитаны?
Спасибо,
Короче говоря, вы рискуете потерять информацию из своей библиотеки из-за длины фрагментов, которые вы секвенируете.
Когда вы настраиваете цикл секвенирования, вы задаете параметр количества циклов секвенирования, который будет определять длину секвенируемых чтений. Чем длиннее фрагменты, содержащиеся в вашей библиотеке, тем менее они будут полностью секвенированы.
Хорошей идеей было бы секвенировать предполагаемые полимеризованные фрагменты, чтобы убедиться, что полимеризация праймера действительно происходит. Просто отправьте свой образец для обычного секвенирования, как для плазмид и ПЦР-фрагментов.
Если ваши праймеры полимеризуются из-за неэффективной конструкции, вам следует исправить это перед загрузкой вашей библиотеки в устройство Illumina. Если эффект праймер-димер составляет значительную часть вашей библиотеки, он будет только усиливаться во время прогона и определенно может привести к значительно менее сложной библиотеке. Секвенирование несложной библиотеки — действительно дорогостоящая ошибка, единственный гарантированный результат которой — разозлить вашего консультанта и заставить его/ее громко усомниться в вашей компетентности. Поверьте мне.
Лес