У меня есть последовательности цитохром с-оксидазы I (COI) из нескольких популяций Peringia ulvae (Mollusca, Gastropoda, Littorinimorpha, Hydrobiidae). Мне нужны дополнительные последовательности COI от определенной группы населения. При использовании тех же праймеров и протокола ПЦР, что и для других популяций, я не получаю никакого продукта ПЦР для конкретной популяции. Мой ИП предложил мне разработать внутренние праймеры COI для Peringia ulvae . Как мне это сделать? Должен ли я использовать последовательности COI из других популяций?
Если вы не получаете амплификацию, есть несколько вещей, которые нужно посетить, прежде чем вы захотите разработать внутренние праймеры. Вам следует попробовать устранить неполадки в реакциях ПЦР, прежде чем разрабатывать и заказывать внутренние праймеры. Если вы делаете ПЦР неправильно, вполне вероятно, что вы снова столкнетесь с теми же проблемами с внутренними праймерами.
Существуют отличные руководства по устранению неполадок с PCR — просто поиск в Google «Устранение неполадок с PCR» должен дать вам много материала для изучения. Это от NEB , но есть и несколько других, у каждого производителя есть свои, так что вы можете обратиться к одному из реагентов, которые вы используете.
Праймеры обычно дают хорошее считывание с 5'-конца примерно на 600-700 п.н., после чего качество вызова базы ухудшается, поэтому, если ваш целевой ампликон выше 1500 п.н. или около того, вам потребуются внутренние праймеры, потому что «внешние» праймеры дадут у вас хорошие последовательности только для 1400 п.н. или около того (600-700 п.н. в обоих направлениях, для праймеров вперед и назад). Таким образом, внутренние праймеры можно использовать для секвенирования областей, которые не могут быть достигнуты основными (внешними) прямыми и обратными праймерами. Опубликованные документы, из которых вы используете внешние праймеры, скорее всего, будут иметь внутренние праймеры, если CO1 достаточно длинный, чтобы потребовать внутренних праймеров.
В противном случае вам нужно будет выровнять существующие последовательности из других популяций и просмотреть сохранившиеся области выравнивания, которые могут действовать как потенциальные сайты прайминга. Есть и другие проблемы, о которых нужно позаботиться, прежде чем вы сможете рассматривать «законсервированную область» как «участок грунтовки» и заказывать грунтовки. Опять же, есть отличные учебники по дизайну для начинающих, просто поищите в Google.
Дайте мне знать, если какие-либо части ответа неясны или звучат как жаргон, и я сделаю все возможное, чтобы упростить его для вас. Тем не менее, я бы настоятельно рекомендовал сначала устранить неполадки ПЦР, например, попробовать градиентную ПЦР, чтобы найти оптимальную температуру отжига.
Джо Хили
алек_джинн
джвддорпе
алек_джинн
джвддорпе