Дана последовательность: 5'-ACTGACTATGTAGAA………GGCCCTAAGGGCCAA-3' (1)
Вы хотите провести ПЦР этой двухцепочечной ДНК, чтобы добавить «выступы» на ее концах. На 5'-конце вы поместите сайт рестрикции для фермента NdeI (5'-CATATG). На 3'-конце вы поместите сайт рестрикции для MspI (5'-CCGG).
Для этого напишите последовательности для «прямого» и «обратного» праймеров. Каждый праймер должен состоять из 16-18 нуклеотидов, из них 12 нуклеотидов для гибридизации и 4-6 нуклеотидов для «выступа».
Я немного запутался, как написать прямой и обратный праймеры для последовательности. Из видео я видел, что я должен написать дополнительную нить моей дающей нити. Что было бы:
3' -TGACTGATACATCTT........CCGGGATTCCCGGTT-5' (2)
Тогда из последовательности (1) я должен получить обратный праймер, а из последовательности (2) — прямой праймер. Однако это не позволяет мне добавлять оба фермента рестрикции, потому что оба праймера будут от 5' до 3'.
Или я должен просто взять заданную последовательность и написать праймеры только от нее? Чтоб праймеры были:
Прямой праймер: 3'- GGCC TGACTGATACAT
Обратный праймер: GGATTCCCGGTT GTATAC - 5'
где жирным шрифтом обозначены сайты рестрикции.
Спасибо!
Как упоминалось в комментариях выше, помните, что вы амплифицируете двухцепочечную ДНК, поэтому в каждом цикле должны генерироваться две новые обратно-комплементарные цепи (чтобы они могли гибридизоваться друг с другом). Как написано в вашем ответе, оба ваших праймера будут гибридизоваться с вашей данной цепочкой, и ампликоны не будут перекрываться (по одному связывается на каждом конце, но оба будут усиливаться в одном направлении).
Чтобы исправить это, вам нужен один праймер, который связывается с последовательностью-мишенью, и один, который связывается с обратной цепью комплемента, которую вы уже создали. Новые ампликоны простираются от 5' -> 3' (от 3'-конца праймера, а не от матрицы ), поэтому ваши праймеры должны связываться на 3'-конце соответствующей нити. Эта ссылка имеет хорошую визуализацию этого.
3'-конец праймера должен тесно гибридизоваться с матрицей, поскольку именно здесь происходит удлинение (обсуждается в этом руководстве ). Таким образом, ваши фланкирующие последовательности сайтов рестрикции всегда будут находиться на 5'-конце любого праймера (обратите внимание, что вопрос на самом деле намекает на это, указывая 5'-конец каждого фланга).
Праймер, указанный как ваш «обратный» праймер, будет фактически связываться с 3'-концом вашей заданной последовательности в соответствующей ориентации, но вы можете поместить свой 3'-фланг на 5'-конец этой последовательности праймера, так как это будет теоретически быть 3'-концом вашего ампликона. Другой ваш праймер должен будет связать 3'-конец вашего обратного комплемента (который является 5'-концом вашей мишени), поэтому он будет иметь 5'-фланг сайта рестрикции.
По соглашению последовательности праймеров всегда даются в формате 5'---3'. Поэтому убедитесь, что ваш ответ соответствует этому соглашению. (т.е. 5'- Фланг -праймер-3').
Если все это звучит действительно запутанно, то это потому, что так оно и есть. Я зарабатываю этим на жизнь и до сих пор всегда перепроверяю свои праймеры в такой программе, как Primer3.
Максимилиан Пресс
Максимилиан Пресс