Как высокая точность репликации ДНК зависит от образования водородных связей?

ДНК-полимераза должна катализировать присоединение 4 разных нуклеотидов к растущей цепи. Это означает, что он не может напрямую определить, какое основание включить в конкретный момент (как он «узнает», какое основание включить и как он изменит свою специфичность для разных оснований). Это означает, что специфичность включения пары оснований зависит от цепи матричной ДНК.

Правильное спаривание оснований Уотсона-Крика (т. е. водородная связь) между матричной цепью и включаемым нуклеотидом запускает закрытие пальцевого домена ДНКП вокруг соединения праймер-матрица и позиционирует последний в оптимальном положении для катализа (с в$\ce{\alpha-PO_4}$входящего нуклеотида вблизи$\ce{3'-OH}$праймера для нуклеофильной атаки, катализируемой двумя$\ce{Mg^{2+}}$ионы). Именно здесь вступает в игру консервативный остаток тирозина, о котором вы упомянули. Неправильно спаренный нуклеотид не вызовет это конформационное изменение и не будет расположен оптимально, поэтому катализ менее вероятен.

Кроме того, ДНК-полимераза контактирует с малой бороздкой соединения праймер-матрица посредством водородных связей. Это взаимодействие не зависит от основания (все пары оснований Уотсона-Крика имеют одинаковую структуру акцепторов водородных связей в малой бороздке), но происходит только при включении правильного нуклеотида, что стабилизирует комплекс.

Наконец, различие между рибонуклеотидами и дезоксирибонуклеотидами осуществляется путем стерического исключения$\ce{2'-OH}$аминокислотными остатками в кармане связывания.

Эти факторы можно рассматривать как кинетическую корректуру, поскольку они просто замедляют скорость реакции и дают время для диссоциации неправильно спаренного нуклеотида. Однако они все еще могут быть включены, и многие ДНК-полимеразы имеют$\ce{3'->5'}$корректирующая экзонуклеаза, которая может удалять неправильно спаренные нуклеотиды. Эта корректура снова опосредована взаимодействиями между DNAP и соединением праймер-матрица (т.е. водородной связью с малой бороздкой). Ослабленное взаимодействие из-за неправильно спаренного основания снижает сродство между ДНК и каталитическим сайтом и увеличивает сродство между ДНК и сайтом корректуры (поскольку он предпочитает расщеплять одноцепочечную ДНК с 3'-конца).

Высокоточные ДНК-полимеразы имеют несколько мер защиты от совершения и распространения ошибок при копировании ДНК.

Такие ферменты имеют значительное предпочтение связывания правильного по сравнению с неправильным нуклеозидтрифосфатом во время полимеризации.

Если неправильный нуклеотид действительно связывается с активным центром полимеразы, включение замедляется из-за неоптимальной архитектуры комплекса активного сайта. Это время задержки увеличивает возможность диссоциации неправильного нуклеотида до прогрессирования полимеразы, тем самым позволяя процессу начаться снова с правильным нуклеозидтрифосфатом (1,2).

Если вставлен неправильный нуклеотид, корректирующие ДНК-полимеразы имеют дополнительную линию защиты.

Обнаружено возмущение, вызванное неправильно спаренными основаниями, и полимераза перемещает 3'-конец растущей цепи ДНК в корректирующий 3'→5' экзонуклеазный домен. Там неправильный нуклеотид удаляется экзонуклеазной активностью 3´→5´, после чего цепь перемещается обратно в полимеразный домен, где полимеризация может продолжаться.

Откуда: биолаборатории Новой Англии:

https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/polymerase-fidelity-what-is-it-and-what-does-it-mean-for-your-pcr

Оба предложения можно понять из приведенного ниже объяснения.

Во вновь синтезируемой цепи ДНК ДНК-полимераза образует обширные водородные связи с вновь добавленным основанием каждый раз, когда добавляется новый нуклеотид. (Первое предложение) Полимераза также образует связи с остовом ДНК фосфата и сахара. (Второе предложение)

В первом предложении говорится о том, как полимераза образует связи через малую бороздку только что синтезированной ДНК. Во втором предложении говорится об изменении аминокислоты из ДНК-полимеразы (что важно для образования связей с остовом ДНК). Это изменение аминокислоты вызовет ошибку в добавленном нуклеотиде (поскольку полимераза расположена неправильно, что вы поймете в следующем объяснении).

Эти связи полимеразы и оснований вместе со связями между остовом ДНК и полимеразой позиционируют ДНК-полимеразу.

Когда вновь добавленный нуклеотид имеет правильную пару оснований, структура спаренных оснований будет такой, что связи, образованные между полимеразой и основанием, позволят ДНК-полимеразе занять положение для добавления следующего нового нуклеотида. Если был добавлен неправильный нуклеотид, ДНК-полимераза позиционируется таким образом, что ее экзонуклеазный сайт находится в положении, катализирующем экзонуклеазную активность.

Таким образом, водородные связи между основанием и полимеразой необходимы для правильного позиционирования полимеразы, чтобы либо позволить добавить следующий нуклеотид (если было добавлено правильное основание), либо обеспечить экзонуклеазную активность полимеразы (если было добавлено неправильное основание). Это поможет в корректуре и, таким образом, обеспечит высокую точность.