Почему среда SOC рекомендуется для трансформаций?

Подводя итог статье Ханахана (см. ссылку ниже), он провел систематический обзор условий, необходимых для повышения эффективности трансфекции. Среди испытанных условий были присутствие различных катионов (Ca ²⁺ , Cs ⁺ , Mn ²⁺ , K ⁺ , Mg ²⁺ ), ДМСО и температуры роста (и несколько других условий, которые не так часто используются в наши дни). Он работал со штаммом, из которого впоследствии выделил производное, названное DH1, которое теперь коммерчески доступно как DH1-альфа и производные других штаммов.

Он определил эффективность трансформации как количество трансформированных колоний на чашке, измерение, используемое до сих пор. Он обнаружил, когда в состав трансформирующих сред входят: некоторые катионы, а именно Mn ²⁺ , Ca ²⁺ , Rb ⁺ ; а также ДТТ, гексамин кобальта (III) и ДМСО; значительно улучшили эффективность трансфекции по сравнению со стандартной обработкой Ca ²⁺ . Он также обнаружил, что сахароза и К ⁺ полезны, хотя и не являются строго необходимыми для его экспериментального штамма. В этой статье было указано, хотя и не объяснено, что сахароза действовала как стабилизатор, возможно, для защиты от первоначального использования им инкубации при 0 ° C и / или циклов замораживания / оттаивания. В остальной части своей работы он не использовал сахарозу.

Среди своих выводов он заявляет, что необходим DTT, а также двухвалентные и одновалентные катионы, но они кажутся неспецифичными. Другими словами, не существует строгих требований к содержанию Ca ²⁺ , поскольку Mg ²⁺ и Mn ²⁺ работают одинаково хорошо, также нет требований к K ⁺ , хотя, по общему признанию, его легче использовать, чем Rb+.

В настоящее время имеется ряд «богатых» питательных сред: SOB, SOC (SOB + MgCl ₂ и сахароза), 2xYT, NZY+, TB и т. д. Все они превосходят LB в целях трансформации из-за рафинированной соли. баланс и, в частности, включение этих двухвалентных и одновалентных катионов. Сахароза, по-видимому, включена для облегчения метаболизма и стабильности процесса теплового шока (хотя я не могу найти статью, в которой подробно объяснялось бы, почему она используется, кроме как по традиции).

Двумя наиболее распространенными способами трансформации бактерий являются их химическая компетенция (E. coli уже в бульоне с богатой средой) или их электрическая трансформация (электропорация). Целью обоих из них является создание отверстий в клеточной мембране кишечной палочки (для этого химическая трансформация зависит от процесса теплового шока). Как только эти отверстия сделаны, ДНК может свободно проникать в бактерии. Естественно, этот процесс очень травматичен для кишечной палочки, особенно потому, что химическая трансформация сопровождается температурным шоком (от 0°C до 42°C, затем снова до 0°C).

Замена LB любым насыщенным бульоном, таким как SOC, значительно повысит выход трансформации. Если протокол требует мультимедиа SOC, а у вас его нет, вы можете заменить его другим мультимедиа. Я довольно успешно использовал 2xYT для SOC много раз, и, как я уже говорил ранее, кажется, что имеет значение только число валентности для различных ионов, поэтому просто убедитесь, что они присутствуют.

Насколько я понимаю, сахароза/глюкоза была добавлена ​​в качестве дополнительного источника питательных веществ для E. coli, чтобы ускорить их восстановление после протокола трансформации. Я предполагаю, что это так. Ханахан называет сахарозу стабилизатором, но не определяет, что именно она стабилизирует. Я предполагаю, что он действует как средство криоконсервации и предотвращает образование кристаллов льда при охлаждении на льду методом теплового шока. Учитывая более ранний вопрос bio.SE о замене исходного сырья для E. coli , маловероятно, что сахароза будет использоваться в качестве источника питательных веществ в течение одного часа роста сразу после трансформации, потому что в этой статье указывается 4-12 часов в качестве общего периода времени для перехода. обмен веществ от аминокислот к углеводам.

Источники:

• Ханахан Д. Исследования по трансформации кишечной палочки плазмидами. J Mol Biol 1983 166(4):557-80.

( Сверхоптимальный бульон с катаболитной репрессией ) Среда SOC содержит глюкозу, тогда как бульон Лурия (LB) ее не содержит. SOB также имеет более тонкий солевой баланс.

Естественно, глюкоза поможет клеткам восстановиться и быстрее расти после теплового шока. Ваша эффективность преобразования должна улучшиться, так как погибнет меньше клеток.

С другой стороны, среда SOC не всегда используется из-за пагубного воздействия слишком большого количества глюкозы. Глюкоза будет потребляться в цикле Кребса и производить много ацетата, который может быть довольно агрессивным для клеток.