Насколько преобладает Taq-полимераза при добавлении 3'-концевых концов A к продукту ПЦР?

Я провожу мутагенез гена in vivo, который мне нужно лигировать в вектор экспрессии. Разработанные мной праймеры перекрывают сайты рестрикции, которые я планирую использовать для лигирования в вектор экспрессии. Части между праймерами я попытаюсь создать мутантами с подверженной ошибкам ПЦР.

Меня беспокоят выступы 3'A, которые образуются из полимеразы Taq. Насколько это распространено? Если это очень распространено, как лучше всего учесть эти добавления при попытке лигировать мой продукт ПЦР в вектор?

Ответы (2)

Я не уверен в случае, когда Taq не добавляет 3' A свеса.

Вы можете использовать клонирование ТА для клонирования продукта ПЦР. Основной принцип заключается в использовании вектора с выступами 3'T. Если у вас есть вектор без этих выступов, вы можете использовать терминальную трансферазу + dTTP для их создания (или даже Taq, но это не так хорошо, потому что добавляется этап очистки для выделения векторов с выступами; терминальная трансфераза намного эффективнее ). Затем вы можете лигировать продукт ПЦР с 3-дюймовым выступом.

Протоколы добавления выступов 3'T к вашему вектору приведены в Zhou and Gomez-Sanchez 2000 .

Полимераза Т4 не добавляет выступающие части (она добавляет их, но затем удаляет), но я думаю, что эта полимераза имеет слишком высокую точность для мутагенеза.
Насколько я понимаю, выступ A' в конечном итоге отваливается. Однако клонирование ТА гораздо проще, если у вас есть вектор ТА.
@Kevin: я пересмотрел свой ответ, включив в него описание клонирования TA, которое вообще не включает полимеразу T4. (Я предполагаю, что вы перепутали букву А с цифрой 4.)
В любом случае, если сайты рестрикции находятся по бокам от продукта ПЦР, вы можете продолжить и выполнить рестрикционное расщепление и лигирование. Если вас слишком беспокоит выступающий конец А, вы можете использовать полимеразу Pfu для ПЦР или, в качестве альтернативы, обработать продукт ПЦР препаратом Кленова.

Используйте pGemT для клонирования продукта ПЦР. Он точно предназначен для продуктов с выступами 3 фута и имеет синий/белый выбор, поэтому это довольно легко сделать! Затем вы вырезаете из pGem сайты рестрикции, добавленные во время ПЦР, и лигируете их в вектор экспрессии.

Насколько преобладает Taq-полимераза при добавлении 3'-концевых концов A к продукту ПЦР?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v