Какой был бы самый короткий и оптимальный метод выделения клеток человека для ПЦР? Существует ли протокол ПЦР колоний для клеток человека?

Я не уверен в своем ответе, но в статье, указанной ниже, есть методы извлечения ДНК из различных типов образцов человека (кровь, волосы, моча, щека).

Как бы то ни было, мои профессора всегда говорили мне, что извлечение ДНК — это больше искусство, чем наука, и нужно повозиться, чтобы сделать это правильно.

Может быть, для чего-то действительно быстрого вы могли бы попробовать «хлюпающий буфер» протеиназы К, а затем кипятить его в течение примерно 10 минут в буфере, а затем попробовать запустить ПЦР. Я всего лишь студент, так что отнеситесь к моим словам с большой долей скептицизма.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3792701/

Вот как они собрали буккальные образцы: буккальные мазки:

Были набраны пять здоровых взрослых добровольцев (возрастной диапазон 22–35 лет), и была собрана демографическая информация, включая возраст, состояние здоровья, пол, происхождение населения, цвет волос и методы лечения волос. Набранных добровольцев попросили прополоскать рот водопроводной водой за 30 с до забора буккальных мазков, чтобы избежать загрязнения частицами пищи. Для каждого человека слизистую оболочку щек с обеих сторон протирали ватным тампоном в течение 15 с, и всего пять образцов собирали в 500 мкл 10 М Трис-HCl, 10 мМ ЭДТА, 2% SDS, содержащих 1,5 мл микроцентрифужных пробирок. . Выделение ДНК проводили с ватных тампонов.

Вот копипаст, дефисы мои.

Экстракция ДНК:

Щечные мазки:

-образцы суспендировали в 500 мкл буфера для лизиса [10 мМ Трис (рН 8,0), 10 мМ ЭДТА и 2,0% SDS] и 50 мкл 10% SDS, а затем 5–10 мкл 20 мг/мл протеиназы K.

- инкубируют 1-3 ч при 56°С до полного растворения ткани

- Затем ДНК экстрагировали из каждого образца равным объемом раствора фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1) и осторожно перемешивали, переворачивая пробирки в течение 3 минут.

- затем образцы центрифугировали (Eppendorf 5415R; Гамбург, Германия) в течение 10 мин при 10 000 g (4°C),

- верхний водный слой переносили в свежую стерилизованную микроцентрифужную пробирку.

Добавляли -РНКазу А (10 мкл 10 мг/мл; Fermentas, Thermo Scientific, Германия) и инкубировали раствор при 37°С в течение 30 мин.

- Добавляли равные объемы раствора хлороформ:изоамиловый спирт и центрифугировали (Eppendorf 5415R) снова при 10 000 g (4°C) в течение 10 мин.

- Верхний водный слой переносили в стерилизованную микроцентрифужную пробирку и добавляли двойной объем охлажденного изопропанола (Merck, Whitehouse Station, NJ, USA) вместе с одной десятой объема 3 М ацетата натрия и охлаждали до -20°С. °С за 1 ч для осадков.

- Через 1 час образец центрифугировали (Eppendorf 5415R) при 10 000 g (4°C) в течение 10 мин.

- после декантации супернатанта добавляли 250 мкл 70% этанола (Merck) и растворяли осадок; смесь центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 10 мин и осторожно декантировали надосадочную жидкость.

- Осадок сушили на воздухе в ламинарном потоке воздуха, а высушенный осадок ресуспендировали в 50 мкл воды, не содержащей нуклеаз, или 1× 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 7,6 (ТЕ), буфера и замораживали при -20°С. °С или при -80°С для хранения.

Я много извлекаю гДНК и вкДНК! То, что объяснил Ро Сив, является довольно стандартным методом извлечения буккального мазка, однако время инкубации pK не обязательно должно быть таким долгим. Золотым стандартом выделения ДНК являются наборы QIAGEN. Специально для вашего использования я бы выбрал что-то вроде QIAamp DNA Mini Kit (вы можете просмотреть их протоколы справочника на их сайте - https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5- 8033-394fa5d752ea&lang=en ) На практике мне удалось сделать 4 образца без автоматизации по их протоколу вращения примерно за 1,5 часа.

Время ПЦР будет зависеть от ваших условий цикла и того, сколько времени вам потребуется, чтобы настроить реакцию и т. Д., А гели будут зависеть от того, насколько точными вам нужны ваши полосы. Я думаю, что все это можно легко сделать за 4-5 часов. По моему опыту, образцы крови занимают немного больше времени, но, очевидно, более инвазивны и менее практичны. Я согласен, что щечный путь. Для справки, мы используем тампоны Puritan Hydraflock, но это на ваше усмотрение.