Насколько сложно определить трехмерную структуру белка?

Экспериментальное определение структуры белка сложно: наиболее распространенным методом является рентгеновская кристаллография, которую можно провести за несколько месяцев, если повезет, и годы, если нет. Проблема с рентгеновской кристаллографией заключается в том, что вам нужны хорошие кристаллы белка, а в большинстве случаев белки не очень хорошо кристаллизуются, поэтому требуется много времени (и много очищенного белка), чтобы получить правильный кристалл. (В разделе комментариев Коди добавил несколько хороших ссылок с более подробной информацией о рентгеновской кристаллографии для определения структуры АТФ-синтазы).

Стоимость в основном зависит от материалов и рабочей силы, которые вам нужны для этого, и вам нужно протестировать множество различных растворов для кристаллизации вашего белка, которые не очень дешевы. Если у вас нет доступа к специализированному оборудованию для изготовления кристаллов (в основном это роботы-пипетки) или к измерению (рентгеновский луч), это будет очень дорого.

Для кристаллографии требуются кристаллы белка, получение которых иногда слишком проблематично. Другие методы, не требующие кристаллов, такие как ЯМР и криоЭМ, еще труднее выполнить, хотя и меньше зависят от удачи. Эти методы основаны на очень дорогом оборудовании и часто не могут определить структуру так же точно, как кристаллография белка. Поэтому, если вы не найдете одного из немногих людей, имеющих опыт работы с этими методами, вы столкнетесь с множеством дополнительных проблем.

Существует также компьютерное предсказание структуры, для которого нужен только мощный компьютер. Однако, если ваш белок не очень похож на белок с известной структурой , он, вероятно, не будет работать надежно. Как уже упоминалось в комментариях, существуют веб-серверы для установленных методов, и постоянно происходит прогресс в новых (более совершенных) алгоритмах, поэтому в зависимости от ваших потребностей определенно стоит попробовать прогнозирование вычислительной структуры.

Я обращусь к ЯМР для определения структуры. Это менее распространенный метод, таким образом определяется только около 10% белковых структур, хотя он имеет преимущества, например, для нуклеиновых кислот, и более трети из них было определено с помощью ЯМР. Воспринимайте любые цифры как очень грубые оценки, есть много факторов, влияющих на сложность и стоимость.

Для ЯМР самым важным фактором является размер. Стабильный белок с массой 10-20 кД — это обычное дело. Крупные белки либо очень трудно измерить, либо вообще невозможно измерить с помощью ЯМР.

Вам нужно большое количество белка для рентгена и ЯМР, но в случае ЯМР вам также нужен изотопно-меченый. Единообразная маркировка белков 15N/13C не так уж и дорога, если вы можете экспрессировать свой белок в E. coli в минимальной среде (около 100 долларов за литр среды или около того, в основном в глюкозе 13C), но это может очень быстро стать очень дорогим, если вы нужен полный средний или что-нибудь необычное.

Ваш белок должен оставаться стабильным в растворе, по крайней мере, в течение нескольких дней, измерение одного 3D-эксперимента может занять несколько дней. Если ваш белок едва достаточно стабилен, вам также придется производить гораздо больше белка, потому что вам нужно использовать много образцов для проведения всех необходимых экспериментов. Сложность здесь заключается в том, что вы не можете добавить много соли в образец ЯМР без резкого снижения чувствительности экспериментов ЯМР. Но некоторые белки трудно стабилизировать в среде с низким содержанием соли.

Вам потребуется около нескольких недель измерений на высокопольном ЯМР-спектрометре, хотя это во многом зависит от размера белка и концентрации, которую вы можете достичь в своем образце, а также от общей сложности определения белковых резонансов. Такой спектрометр может стоить несколько миллионов, и вам нужно поставлять жидкий азот и жидкий гелий, чтобы они работали. Что-то вроде 1000 долларов в день за время измерения — это цифра, которую я слышал о стоимости, но на это влияет множество факторов, и я не могу сказать, насколько точна эта цифра.

Затем вам нужно задать резонансы в вашем белке, что у одного человека занимает несколько месяцев. Это опять же сильно зависит от сложности.

Затем вам нужно рассчитать структуру, и обычно это требует нескольких раундов уточнения задания и анализа, а также повторных вычислений. Это не очень дорого с точки зрения вычислительной мощности, но требует немало усилий от человека, выполняющего расчеты и проверяющего их.