Неточное секвенирование на сайте праймера

Время, когда я отправлял образец для секвенирования, как прямого, так и обратного праймеров, показывает высокую неточность, в то время как остальная часть гена секвенирована правильно. Из-за этого последовательности моей конструкции in silico и секвенированного образца в этом разделе не совпадают; но они совпадают по остальным генам почти на 100%.

Для этого есть причина? Является ли это просто артефактом секвенирования или я должен доверять секвенированному образцу и предположить, что сайты праймеров мутировали?

Начало всегда фигня, можно смело не обращать внимания. Однако тот факт, что у вас есть результат секвенирования, означает, что 3'-конец вашего праймера соответствует шаблону.

Ответы (1)

Самые крайние считывания секвенирования, полученные с помощью большинства, если не всех технологий секвенирования, обычно имеют более низкое качество, хотя чаще в 5'-области. Вы должны игнорировать эти данные или, что еще лучше, разработать дополнительные праймеры дальше, чтобы инкапсулировать и этот регион, если он вам отчаянно нужен.

Ниже приведен довольно типичный результат анализа FASTQC данных секвенирования Illumina. Вы можете видеть, что качество находится на пике в середине считываемого (базового индекса по оси x). Скорее всего, вы увидите нечто подобное для секвенирования по Сэнгеру, которое, предположительно, вы используете.

введите описание изображения здесь

Что может означать хороший результат? и какой будет хороший результат? Судя по цветам, я представляю, что все на зеленом хорошо, но просто нужно немного больше узнать о последовательности.
Это может варьироваться в зависимости от технологии секвенирования, но большинство техников в наши дни используют то, что называется подсчетом очков «Phred-33». Это логарифмическая зависимость, которая, грубо говоря, означает, что оценка Phred, равная 30 (по оси Y на рисунке выше), означает, что существует только 1 шанс из 1000, что база была названа неправильно. Большинство людей принимают 30 как разумное качество для секвенирования, чему также способствует тот факт, что у вас есть много миллионов перекрывающихся прочтений (в NGS), поэтому даже если основание неправильно вызывается в 1 прочтении, есть вероятность, что есть много других прочтений, на которые вы можете ссылаться. к тому, что бы иметь правильный вызов.
Неточное секвенирование на сайте праймера
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v